1. Početno razumijevanje

U ovoj fazi moramo razumjeti neke pojmove i terminologiju kako bismo izbjegli pogreške pred našim starijim osobama, kao što su:

P: Koja je razlika između RT-PCR-a, qPCR-a, PCR-a u stvarnom vremenu i RT-PCR-a u stvarnom vremenu?

Odgovor: RT-PCR je PCR obrnute transkripcije(reverse transcription PCR, RT-PCR), koja je široko korištena varijanta lančane reakcije polimerazom (PCR).U RT-PCR-u, RNA lanac se reverzno transkribira u komplementarnu DNA, koja se zatim koristi kao predložak za umnožavanje DNA pomoću PCR-a.
PCR i qPCR u stvarnom vremenu(Quantitative Rea-ltime-PCR) su ista stvar, oba su kvantitativna PCR u stvarnom vremenu, što znači da svaki ciklus PCR-a ima zapise podataka u stvarnom vremenu, tako da se broj početnih predložaka može prilagoditi preciznoj analizi.

Iako se čini da se i PCR u stvarnom vremenu (fluorescentni kvantitativni PCR u stvarnom vremenu) i PCR s obrnutom transkripcijom (PCR s obrnutom transkripcijom) nazivaju skraćenicom RT-PCR, međunarodna konvencija glasi: RT-PCR se posebno odnosi na obrnutu transkripcijuPCR , PCR u stvarnom vremenu općenito se skraćeno naziva qPCR (kvantitativni PCR u stvarnom vremenu).

I RT-PCR u stvarnom vremenu (RT-qPCR), to je PCR s obrnutom transkripcijom u kombinaciji s fluorescentnom kvantitativnom tehnologijom: prvo dobijte cDNA (RT) iz RNA reverzne transkripcije, a zatim upotrijebite PCR u stvarnom vremenu za kvantitativnu analizu (qPCR).Većina laboratorija radi RT-qPCR, to jest istraživanje o regulaciji ekspresije RNA, tako da se qPCR o kojem svi pričaju u laboratoriju zapravo odnosi na RT-qPCR, ali ne zaboravite da još uvijek postoji mnogo DNK testova u kliničkim primjenama.Kvantitativna analiza, kao što je otkrivanje HBV virusa hepatitisa B.

Pitanje: Nakon čitanja puno fluorescentnog kvantitativnog PCR-a, zašto bi se amplificirani fragment trebao kontrolirati unutar raspona od 80-300 bp?

Odgovor: Duljina svake genske sekvence je različita, neke su nekoliko kb, neke stotine bp, ali trebamo samo zahtijevati da duljina proizvoda bude 80-300 bp kada dizajniramo početnice, prekratke ili preduge nisu prikladne za fluorescentnu kvantitativnu PCR detekciju.Fragment proizvoda je prekratak da bi se razlikovao od primera-dimera.Duljina primer-dimera je oko 30-40bp, a teško je razlučiti radi li se o primer-dimeru ili produktu ako je manja od 80bp.Ako je fragment produkta predugačak, veći od 300 bp, to će lako dovesti do niske učinkovitosti pojačanja i ne može učinkovito otkriti količinu gena.

Na primjer, kada brojite koliko je ljudi u učionici, trebate samo brojati koliko ima usta.Isto vrijedi i kada otkrivate gene, samo trebate otkriti određenu sekvencu gena da biste je predstavili. Cijela sekvenca će biti dovoljna.Ako želite brojati ljude, morate brojati i usta i nosove, uši i naočale, a lako je pogriješiti.

Da proširimo, u biološkim istraživanjima postoji mnogo slučajeva istraživanja od točke do područja, budući da je sekvenca gena bilo koje vrste vrlo duga, nepotrebno je i nemoguće mjeriti sve fragmente, kao što je bakterijsko 16S sekvenciranje, što znači provesti konzervativne analize sekvence bakterija kako bi se zaključio broj određene populacije bakterija.

P: Koja je optimalna duljina za dizajn početnice za qPCR?

Odgovor: Općenito govoreći, duljina primera je oko 20-24bp, što je bolje.Naravno, pri projektiranju temeljnog premaza moramo obratiti pozornost na TM vrijednost temeljnog premaza jer je to povezano s optimalnom temperaturom žarenja.Nakon mnogo eksperimenata, dokazano je da je 60°C bolja TM vrijednost.Ako je temperatura žarenja preniska, lako će doći do nespecifičnog pojačanja.Ako je temperatura žarenja previsoka, učinkovitost pojačanja bit će relativno niska, vrhunac krivulje pojačanja počet će kasnije, a CT vrijednost će kasniti.

P: Kako se metoda bojenja razlikuje od metode sonde?

Odgovor: Metoda bojanjaNeke fluorescentne boje, kao što su SYBR Green Ⅰ, PicoGreen, BEBO, itd., same ne emitiraju svjetlost, ali će emitirati fluorescenciju nakon što se vežu za manji žlijeb dvolančane DNA.Stoga, na početku PCR reakcije, stroj ne može otkriti fluorescentni signal.Kada reakcija dosegne stadij žarenja-produženja, dvostruki lanac se otvara, te se pod djelovanjem DNA polimeraze sintetizira novi lanac, a fluorescentna molekula se veže na manji žlijeb dsDNA.Kako se broj PCR ciklusa povećava, sve više i više boja se kombinira s dvolančanom DNK, a fluorescentni signal se također kontinuirano pojačava.Metoda bojanja uglavnom se koristi u znanstvenim istraživanjima.
PS: Budite oprezni pri izvođenju eksperimenta, boja se mora kombinirati s ljudskom DNK, pazite da je pretvorite u fluorescentnu osobu.

Metoda bojanja (lijevo) Metoda sonde (desno)
PS: Budite oprezni pri izvođenju eksperimenta, boja se mora kombinirati s ljudskom DNK, pazite da je pretvorite u fluorescentnu osobu.

SYBR Green Ⅰ veže se za manji žlijeb DNK

Metoda sondeTaqmanova sonda je najčešće korištena sonda za hidrolizu.Postoji fluorescentna skupina na 5' kraju sonde, obično FAM, a sama sonda je sekvenca komplementarna ciljnom genu.Postoji grupa za gašenje fluorescentne svjetlosti na 3′ kraju.Prema principu fluorescentnog rezonantnog prijenosa energije (Försterov rezonantni prijenos energije, FRET), kada su reporterska fluorescentna skupina (donorska fluorescentna molekula) i gasna fluorescentna skupina (akceptorska fluorescentna molekula) pobuđene Kada se spektri preklapaju i udaljenost je vrlo blizu (7-10 nm), pobuda donorske molekule može inducirati fluorescenciju akceptorske molekule, dok je autofluorescencija oslabljena.Stoga, na početku PCR reakcije, kada je sonda slobodna i netaknuta u sustavu, reporterska fluorescentna skupina neće emitirati fluorescenciju.Prilikom žarenja, primer i sonda se vežu za šablonu.Tijekom faze produženja, polimeraza kontinuirano sintetizira nove lance.DNA polimeraza ima 5'-3' egzonukleaznu aktivnost.Kada dođe do sonde, DNA polimeraza će hidrolizirati sondu iz kalupa, odvojiti reportersku fluorescentnu skupinu od prigušivačke fluorescentne skupine i otpustiti fluorescentni signal.Budući da postoji odnos jedan-na-jedan između sonde i predloška, ​​metoda sonde je bolja od metode bojanja u smislu točnosti i osjetljivosti testa.U dijagnostici se uglavnom koristi metoda sonde.

P: Što je apsolutna kvantifikacija?Što je relativna kvantifikacija?

Odgovor: Apsolutna kvantifikacija odnosi se na izračun početnog broja kopija uzorka koji se testira qPCR-om, primjerice koliko HBV virusa ima u 1 ml krvi.Rezultat dobiven relativnom kvantifikacijom je promjena u količini ciljnog gena u određenom uzorku u odnosu na drugi referentni uzorak, a ekspresija gena je regulirana naviše ili naniže.

P: Hoće li količina ekstrakcije RNA, učinkovitost obrnute transkripcije i učinkovitost pojačanja utjecati na eksperimentalne rezultate?
P: Hoće li skladištenje uzorka, reagensi za ekstrakciju, reagensi za obrnutu transkripciju i potrošni materijal koji propušta svjetlost utjecati na eksperimentalne rezultate?
P: Koja metoda može ispraviti eksperimentalne podatke?

Što se tiče ovih problema, detaljno ćemo ih opisati u naprednim i naprednim odjeljcima u nastavku.
2. Napredno znanje

Što se tiče fluorescentnog kvantitativnog PCR-a u stvarnom vremenu, moramo prepoznati realnost da se svake godine objavi tisuće znanstvenih istraživačkih radova, među kojima fluorescentna kvantitativna PCR tehnologija nije mali broj.

Ako ne postoji zajednički standard za mjerenje fluorescentnog kvantitativnog PCR eksperimenta, rezultati mogu uvelike varirati.Za isti gen iste vrste, s istom metodom obrade, rezultati detekcije također će se jako razlikovati, a onima koji kasne će biti teško ponoviti iste rezultate.Vi Nitko ne zna što je ispravno, a što krivo.

Znači li to da je fluorescentni kvantitativni PCR tehnologija varanja ili nepouzdana tehnologija?Ne, to je zato što je fluorescentni kvantitativni PCR osjetljiviji i točniji, a malo pogrešna operacija će proizvesti potpuno suprotne rezultate.Mali gubitak je tisuću milja daleko.Autor članka može biti više puta mučen od strane recenzenata.Istodobno, recenzentima časopisa također je teško birati između različitih eksperimentalnih rezultata.

Sve u svemu, ukazuje na nedostatak konsenzusa u PCR eksperimentima u stvarnom vremenu.U tu svrhu, stariji znanstvenici u industriji počeli su formulirati standarde,zahtijevanje od suradnika da daju neke potrebne detalje o eksperimentima i obradi podataka (uključujući potrebne podatke) u članku kako bi zadovoljili ove standarde.

Recenzenti mogu ocijeniti kvalitetu eksperimenta čitajući ove pojedinosti;budući čitatelji također mogu ovo koristiti za ponavljanje eksperimenta ili poboljšanje eksperimenta.Tada su tako dobiveni eksperimentalni rezultati informativni, kvalitetni i upotrebljivi.

MIBBI (Minimum informacija za biološka i biomedicinska ispitivanja -http://www.mibbi.org) nastao.MIBBI je projekt koji daje standarde za eksperimente.Izdaje se u naravi.Ovaj je projekt usmjeren na razne biološke pokuse, uključujući staničnu biologiju, Microarray, qPCR o kojima ćemo sada raspravljati, itd., i predviđa svaku vrstu pokusa prilikom podnošenja rukopisa.Te informacije treba pružiti u svakom trenutku.

U projektu MIBBI dva su članka vezana za fluorescentni kvantitativni PCR, tj.:
·RDML (Real-Time PCR Data Markup Language) – strukturirani jezik i vodič za izvješćivanje za kvantitativne PCR podatke u stvarnom vremenu;
·MIQE (Minimum informacija za objavu kvantitativnih PCR eksperimenata u stvarnom vremenu) – minimum informacija za objavljivanje članaka o kvantitativnim PCR eksperimentima u stvarnom vremenu.
Prvo, razgovarajmo o RDML-u, terminološkoj specifikaciji.

Ako za sve ne postoji standardna definicija, nemoguće je nastaviti raspravu, zato je objašnjenje pojmova toliko važno na ispitu.
Terminologija korištena u fluorescentnom kvantitativnom PCR eksperimentu uključuje sljedeći sadržaj.QIAGEN je napravio najbolji sažetak za nas.Sljedeće su sve suheroba .

Krivulja pojačanja
Krivulja amplifikacije odnosi se na krivulju napravljenu tijekom PCR procesa, s brojem ciklusa kao apscisom i intenzitetom fluorescencije u stvarnom vremenu tijekom reakcije kao ordinatom.

Izvrsna krivulja pojačanja trebala bi imati sljedeće karakteristike: osnovna linija je ravna ili blago smanjena i nema očitog uzlaznog trenda;točka infleksije krivulje je jasna, a nagib eksponencijalne faze proporcionalan je učinkovitosti pojačanja.Što je veći nagib, veća je učinkovitost pojačanja;ukupna krivulja pojačanja. Paralelizam je dobar, što ukazuje da je učinkovitost pojačanja svake cijevi slična;očita je eksponencijalna faza krivulje pojačanja uzoraka niske koncentracije.

Osnovna linija (Osnovna linija)
Osnovna vrijednost je razina buke ranog ciklusa, obično se mjeri između 3. i 15. ciklusa, jer se povećanje vrijednosti fluorescencije uzrokovano produktom pojačanja ne može otkriti tijekom tog razdoblja.Broj ciklusa koji se koristi za izračunavanje osnovne vrijednosti može varirati i možda će ga trebati smanjiti ako se koriste velike količine uzorka ili ako je razina ekspresije ciljnog gena visoka.

Postavljanje osnovne linije zahtijeva pregled podataka o fluorescenciji iz krivulje pojačanja linearnosti.Osnovna linija je postavljena tako da rast krivulje pojačanja počinje s brojem ciklusa većim od gornjeg broja osnovnog ciklusa.Polazne vrijednosti moraju se postaviti zasebno za svaki ciljni niz.Prosječne vrijednosti fluorescencije otkrivene u ranim ciklusima potrebno je oduzeti od vrijednosti fluorescencije dobivenih u pojačanim proizvodima.Najnovije verzije različitih softvera za PCR u stvarnom vremenu omogućuju automatsku optimizaciju osnovnih postavki za pojedinačne uzorke.

Tijekom prvih nekoliko ciklusa PCR reakcije pojačanja, signal fluorescencije se ne mijenja mnogo.Približavanje ravnoj liniji naziva se osnovnom linijom, ali ako pomno pogledamo prvih nekoliko ciklusa, vidimo da se unutar osnovne linije nalazi ono što se događa na slici ispod.

Pozadina Pozadina se odnosi na
vrijednost nespecifične fluorescencije u reakciji.Na primjer: neučinkovito gašenje fluorescencije;ili veliki broj dvolančanih DNA šablona zbog upotrebe SYBR Greena.Pozadinske komponente signala matematički su uklonjene softverskim algoritmom PCR u stvarnom vremenu.

Reporterski signal
Reporterski signal odnosi se na fluorescentni signal koji generira SYBR Green ili fluorescentno obilježene sonde specifične za sekvencu tijekom PCR-a u stvarnom vremenu.

Normalizirani reporter signal (RN)
RN se odnosi na intenzitet fluorescencije reporterske boje podijeljen s intenzitetom fluorescencije pasivne referentne boje izmjeren u svakom ciklusu.

Pasivna referentna boja
U nekim PCR-ovima u stvarnom vremenu,fluorescentna boja ROX koristi se kao interna referenca za normalizaciju fluorescentnog signala.Ispravlja varijacije zbog netočnog pipetiranja, položaja jažice i fluktuacija fluorescencije na osnovi svake jažice.

Prag fluorescencije (prag)
je podešen iznad pozadinske vrijednosti i značajno ispod vrijednosti platoa krivulje pojačanja.Mora ležati u linearnom području krivulje pojačanja, predstavljajući logaritamski linearni raspon PCR detekcije.Pragove treba postaviti u prikazu krivulje logaritmanskog pojačanja tako da se logaritamsko-linearna faza PCR-a može lako identificirati.Ako postoji više ciljnih gena u PCR-u u stvarnom vremenu, prag se mora postaviti za svaki cilj.Općenito, signal fluorescencije prvih 15 ciklusa PCR reakcije koristi se kao pozadinski signal fluorescencije, a prag fluorescencije je 10 puta veći od standardne devijacije signala fluorescencije prvih 3 do 15 ciklusa PCR, a prag fluorescencije je postavljen u eksponencijalnoj fazi PCR pojačanja.Općenito, svaki instrument ima svoj prag fluorescencije postavljen prije upotrebe.

Prag ciklusa (CT) ili točka križanja (CP)
Ciklus u kojem krivulja pojačanja prelazi prag (tj. točka u kojoj se detekcija fluorescencije značajno povećava).CT može biti razlomak i može se izračunati količina početnog predloška.CT vrijednost predstavlja broj ciklusa doživljenih kada fluorescentni signal u svakoj PCR reakcijskoj epruveti dosegne postavljeni prag.Postoji linearni odnos između CT vrijednosti svakog predloška i logaritma početnog broja kopije predloška,veći je početni broj kopija, manja je CT vrijednost i obrnuto.Standardna krivulja može se napraviti korištenjem standarda s poznatim početnim brojem kopije, pri čemu apscisa predstavlja CT vrijednost, a ordinata predstavlja logaritam početnog broja kopije.Stoga, sve dok se dobije CT vrijednost nepoznatog uzorka, početni broj kopija uzorka može se izračunati iz standardne krivulje.

ΔCT vrijednost
ΔCT vrijednost opisujerazlika između ciljnog gena i odgovarajućeg endogenog referentnog gena CT vrijednosti, kao što je gen za domaćinstvo, i koristi se za normalizaciju količine korištenog predloška:
⇒ΔCT = CT (ciljni gen) – CT (endogeni referentni gen)

ΔΔCT vrijednost
Vrijednost ΔΔCT opisuje razliku između srednje vrijednosti ΔΔCT uzorka od interesa (npr. stimuliranih stanica) i srednje vrijednosti ΔΔCT referentnog uzorka (npr. nestimuliranih stanica).Referentni uzorak naziva se i kalibracijski uzorak, a svi ostali uzorci normalizirani su na ovo za relativnu kvantifikaciju:
⇒ΔΔCT = prosječni ΔCT (uzorak od interesa) – prosječni ΔCT (referentni uzorak)

Endogeni referentni geni (endogeni referentni geni)
Razine ekspresije endogenih referentnih gena, kao što su geni za domaćinstvo (geni za domaćinstvo), ne razlikuju se među uzorcima.Usporedba CT vrijednosti referentnog gena s ciljnim genom omogućuje normalizaciju razine ekspresije ciljnog gena na količinu ulazne RNA ili cDNA (pogledajte gornji odjeljak o ΔCT vrijednostima).

Interni referentni geni ispravni zamoguću degradaciju RNA ili prisutnost inhibitora enzima u uzorcima RNA, kao i varijacije u sadržaju RNA, učinkovitost obrnute transkripcije, oporavak nukleinske kiseline i rukovanje uzorkom.Kako bismo odabrali optimalni referentni gen(e), modificirali smo algoritam kako bismo omogućili odabir optimalne reference ovisno o eksperimentalnoj postavci.

Unutarnja kontrola
Kontrolna sekvenca koja se pojačava u istoj reakciji kao ciljna sekvenca i ispituje se drugom sondom (tj. izvođenjem dupleksne PCR).Unutarnje kontrole se često koriste za isključivanje neuspjelih pojačanja, kao što je slučaj kada ciljna sekvenca nije otkrivena.
Uzorak kalibracije
Referentni uzorak (na primjer, pročišćena RNA iz stanične linije ili tkiva) koji se koristi u relativnoj kvantifikaciji za usporedbu svih drugih uzoraka kako bi se odredila relativna razina ekspresije gena.Uzorak za kalibraciju može biti bilo koji uzorak, ali obično je to kontrola (na primjer, neobrađeni uzorak ili uzorak iz nultog vremena eksperimenta).

Pozitivne kontrole
koristiti kontrolne reakcije sapoznate količine predloška.Pozitivne kontrole se često koriste za provjeru radi li set primera ili set primer-sonda ispravno i je li reakcija ispravno postavljena.

Bez kontrole predloška (NTC)
Kontrolna reakcija koja sadrži sve potrebne komponente reakcije pojačanja osim predloška koji se obično zamjenjuje vodom.Korištenje NTC-a može pronaći kontaminaciju uzrokovanu kontaminacijom reagensa ili stranom DNK, čime se osigurava autentičnost i pouzdanost podataka detekcije.Pojačanje NTC kontrole ukazuje na kontaminaciju.

Nema RT kontrole (NRT)
Proces ekstrakcije RNK može sadržavati zaostalu genomsku DNK, koja je izuzetno štetna i krivac je za kvalitetu podataka i prirodni je neprijatelj qPCR-a, tako da pri dizajniranju eksperimenata mora biti dizajniran da samo pojača detekciju RNK.Postoje dva načina, jedan je dizajn početnica preko introna, drugi je potpuno uklanjanje DNK, koji je bolji, o čemu ćemo kasnije govoriti.NTR kontrola je čarobno ogledalo za otkrivanje onečišćenja DNK.Ako postoji pojačanje, to znači da postoji zagađenje.

Standardi
Standardi su uzorci poznate koncentracije ili broja kopija koji se koriste za izradu standardne krivulje.Kako bi se osigurala stabilnost standarda, fragment gena obično se klonira u plazmid i koristi kao standard.

Standardna krivulja
obično se razrijedi u najmanje 5 koncentracijskih gradijenata sa standardnim produktom u skladu s omjerom udvostručenja, a 5 točaka se crta u koordinatama CT vrijednosti i broja kopija, a točke se povezuju u liniju kako bi se stvorila standardna krivulja.Za svaku standardnu ​​krivulju potrebno je provjeriti njezinu valjanost.Vrijednost nagiba pada između –3,3 i –3,8, a svaka se koncentracija provodi u tri primjerka.Točke koje se značajno razlikuju od ostalih točaka treba odbaciti.CT vrijednost uzorka koji se testira dovodi se u standardnu ​​krivulju i može se izračunati razina ekspresije uzorka koji se testira.

CT vrijednost uzorka koji se ispituje dovodi se u standardnu ​​krivulju i može se izračunati početni broj kopija uzorka koji se ispituje.

Učinkovitost i nagib
Nagib standardne krivulje predstavlja učinkovitost PCR-a u stvarnom vremenu.
· Nagib od -3,322 pokazuje da je učinkovitost PCR pojačanja 1 ili 100% učinkovita, a količina PCR produkta se udvostručuje u svakom ciklusu.
· Nagib manji od –3,322 (npr. –3,8) označava učinkovitost PCR-a
·Nagib veći od –3,322 (npr. –3,0) ukazuje na to da se čini da je učinkovitost PCR-a veća od 100%, što je zanimljivo, kako bi jedan ciklus PCR-a mogao generirati više nego dvostruko pojačani produkt?Ova situacija se događa u nelinearnoj fazi PCR reakcije, odnosno postoji velika količina nespecifičnog pojačanja.

krivulja taljenja
Nakon što je qPCR amplifikacija završena, PCR proizvod se zagrijava.Kako temperatura raste, dvolančani produkt pojačanja postupno se topi, što rezultira smanjenjem intenziteta fluorescencije.Kada se postigne određena temperatura (Tm), veliki broj proizvoda će se rastopiti.Fluorescencija naglo opada.Različiti PCR proizvodi imaju različite Tm vrijednosti i različite temperature taljenja, tako da se može identificirati specifičnost PCR-a.

Krivulja taljenja (krivulja derivacije)
Krivulja taljenja je izvedena kako bi se formirala karta vrhova, koja može intuitivnije prikazati situaciju fragmenata PCR proizvoda.Budući da je temperatura taljenja vrijednost Tm fragmenta DNA, mogu se procijeniti neki parametri koji utječu na vrijednost Tm fragmenta DNA, kao što su veličina fragmenta, GC sadržaj itd. Općenito govoreći, prema našim načelima dizajna primera,duljina amplificiranog produkta je u rasponu od 80-300 bp, tako da temperatura taljenja treba biti između 80°C i 90°C.

Tumačenje krivulje taljenja: Ako se jedini glavni vrh pojavljuje između 80°C-90°C, to znači da je fluorescentni kvantitativni PCR savršen;ako se glavni vrh pojavljuje između 80°C-90°C, a razni vrhovi se pojavljuju ispod 80°C, u osnovi se uzima u obzir početni dimer.Možete pokušati povećati temperaturu žarenja da biste to riješili;ako se glavni vrh pojavi između 80°C-90°C, a razni vrh se pojavi ponovno kada temperatura poraste, u osnovi se smatra da postoji kontaminacija DNK, a DNK je potrebno ukloniti u početnoj fazi eksperimenta.

Naravno, još uvijek postoje neke nenormalne situacije, koje ćemo u nastavku raščlaniti jednu po jednu.
3. Napredno znanje

Da bih napravio qPCR, moram reći MIQE,Minimum informacijaza objavuKvantitativnoPCR u stvarnom vremenuEksperimenti — minimum informacija za objavljivanje članaka o kvantitativnom PCR-u u stvarnom vremenupokusi .Kako bismo svima olakšali razumijevanje, pojednostavit ćemo ključni sadržaj.

Izvorni tekst MIQE možete pretražiti na internetu, a najvažnije je da propisujepopis podataka koji je potrebno dostaviti prilikom objave članka .

Recenzenti mogu ocijeniti kvalitetu eksperimenta čitajući ove pojedinosti;budući čitatelji također mogu ovo koristiti za ponavljanje ili poboljšanje eksperimenta.
Važno je napomenuti da je na ovom popisu važnost svakog popisa označena s E odnosno D.Što to znači?E: bitne informacije (obavezno se dostaviti);D: poželjne informacije (navedite što više).

MIQE (1)—Eksperimentalni dizajn
Mnogi đubre koji su završili obranu nakon završenog diplomskog studija neće znati samostalno osmisliti eksperiment, otvoriti bilježnicu i raditi što im profesor kaže.Kao rezultat toga, eksperimentalni dizajn nije bio rigorozan, a uredništvo časopisa je reklo da žele izmisliti ovu i onu sliku, pa su to napravili u bunilu.Ovako nastaju ološi!

Bliže kući, prvi princip eksperimenta je odreditistrogost eksperimentalne logike.Najvažnija stvar je eksperimentalni dizajn, a najvažnija stvar kod eksperimentalnog dizajna je kako postaviti ciljni uzorak, referentni uzorak (kontrolu) i broj ponavljanja, tako da eksperimentalni podaci mogu biti referentni, usporedivi i uvjerljivi.

Ciljni uzorakodnosi se na uzorak koji od nas zahtijeva otkrivanje ciljnog gena nakon određenog tretmana.Referentni uzorakje uzorak bez ikakvog tretmana, koji se u biologiji često naziva divlji tip.

Eksperimentalne replikesu vrlo važni.Općenito, broj uvjerljivih ponavljanja mora biti veći od tri.Potrebno je razlikovati što je biološka replikacija, a što tehnička replikacija.

Biološki replikati: Isti verifikacijski eksperiment obavljen s različitim materijalima (vrijeme, biljke, šarže, reakcijske ploče).

Biološko umnožavanje
Uzmimo za primjer tretiranje paprike pesticidima.Želimo raspršiti pesticide na tri biljke ABC-a, tada su tri biljke ABC-a tri biološke replike, i isti su verifikacijski eksperiment proveden s različitim materijalima.Ali kao pokus, kontrola je svakako potrebna, tako da možemo prskati jednu od grana biljke A da formiramo pokusnu skupinu biljke A, a ne prskati druge grane biljke A da formiramo kontrolnu skupinu.Učinite isto za B i C.

Tehničke kopije (Tehničke kopije): To je ponovljeni eksperiment osmišljen kako bi se izbjegle pogreške uzrokovane operacijom, koja je zapravo dvostruka rupa uključena u isti materijal.I tretmani i kontrole moraju imati replikacijske postavke (najmanje tri) ciljnog gena i internog referentnog gena.

Tehničko ponavljanje
Uzmimo opet za primjer papriku tretiranu pesticidima.Za eksperimentalnu skupinu biljke A, napravili smo tri PCR rupe od 1, 2 i 3 za njen ciljni gen i unutarnji referentni gen, kako bismo uzeli prosjek nakon detekcije.Za kontrolu biljaka A skupine se također tretiraju na isti način.Slično, učinite isti tretman za B i C biljke.Ovo je tehničko ponavljanje.

Vrijedno je napomenuti daono što ulazi u statistiku je biološko ponavljanje, a tehničko ponavljanje je da se ispita ima li slučajnih pojava u eksperimentalnom procesu, kako bi eksperimentalni rezultati bili vjerodostojni, odnosno da bi se izbjegle pogreške uzimajući njihov prosjek kako često kažemo.

Negativne kontrole—NTC i NRT
NTC (kontrola bez predloška), kontrola bez predloška, ​​koristi se za provjeru je li eksperimentalni materijal kontaminiran.Općenito, voda se koristi kao predložak.Ako postoji fluorescentna reakcija, to znači da je u laboratoriju došlo do kontaminacije nukleinskom kiselinom.

Ova onečišćenja dolaze od: nečiste vode, nekvalificiranih reagensa koji sadrže endogenu DNA, onečišćenja početnim slojem, onečišćenja laboratorijske opreme, onečišćenja aerosolom itd., potrebno je koristiti čistače RNaze i inhibitore RNaze.Najteže je pronaći zagađenje aerosolom.Zamislite da je vaš laboratorij poput smoga, s raznim nukleinskim kiselinama lebdećim u zraku.

NRT (bez reverzne transkriptaze), kontrola bez reverzne transkripcije, je nereverzno transkribirana RNA kao negativna kontrola, koja je kontrola gDNA ostatka.

Kada se vrši ekspresija gena, količina RNA se otkriva otkrivanjem količine cDNA nakon obrnute transkripcije.Ako postoji ostatak gDNA kada se RNA pročišćava, to će uzrokovati pogreške u eksperimentalnim rezultatima, jer su stvarni dobiveni rezultati gDNA i cDNA.Na razini agregata, ne samo cDNA, gDNA treba biti potpuno uklonjena tijekom ekstrakcije RNA.

MIQE (2)—uzorak podataka
Tzv. ogledni podatak znači da kada objavljujemo članak o qPCR-u, moramo jasno objasniti uzorak koji je neizostavan dio članka.Slično tome, kada obrađujemo uzorke, također moramo regulirati naše vlastite operacije kako bismo osigurali valjanost uzoraka.

Opis uzorka samo je rezultat, a potrebno je obratiti više pozornosti na materijale koji su uzeti tijekom cijelog eksperimenta.

Izbor eksperimentalnog materijala
Uzorci krvi – odaberite svježu krv, ne više od 4 sata.Uzorci stanica – odaberite prikupljanje svježih stanica u razdoblju snažnog rasta.Životinjsko tkivo – odaberite svježe tkivo koje snažno raste.Biljno tkivo – Odaberite svježe, mlado tkivo.

Sigurno ste primijetili da u ovih nekoliko rečenica postoji ključna riječ: svježe .
Za gore navedene uzorke, najbolji, isplativ i stabilan kit na tržištu je Foregene kit, koji može brzo i jednostavno ekstrahirati njihovu DNK i RNK.

Mini komplet DNK krvi

Cell Total RNA Isolation Kit

Komplet za izolaciju ukupne životinjske RNK

Komplet za izolaciju ukupne biljne RNK

Plant Total RNA Isolation Kit Plus

Set za izolaciju DNK biljke

Skladištenje eksperimentalnog materijala
Općenito govoreći, ne preporučamo pohranjivanje uzoraka, ako to uvjeti dopuštaju.Međutim, ima mnogo prijatelja koji ne mogu provoditi pokuse odmah nakon uzorkovanja, a neki čak moraju nositi spremnike s tekućim dušikom na teren za uzorkovanje.

Za ovakvog vrijednog prijatelja mogu samo reći da se ne razumiješ u potrošni materijal za reagense.Danas mnoge tvrtke koje se bave potrošnim reagensima proizvode reagense koji mogu pohraniti uzorke RNA na sobnoj temperaturi, a vi ih možete koristiti.Konvencionalna metoda skladištenja je skladištenje tekućeg dušika, korištenjem malog spremnika tekućeg dušika koji se lako nosi.Nakon što uzorak vratite u laboratorij, pohranite ga u hladnjak na -80°C.

Za eksperimente koji uključuju RNA, mora se slijediti načelo od šest riječi:niska temperatura, bez enzima,ibrzo .

Koncept niske temperature je lako razumjeti;bez enzima, RNaza je posvuda u svijetu u kojem živimo (inače bi vas ubio HIV), pa je vrlo važan koncept kako izbjeći RNazu pri izvođenju pokusa;brzo,Ne postoji kung fu na svijetu koji se ne može slomiti, samo se brzina ne može slomiti.

Stoga, u određenom smislu, što je kraće vrijeme ekstrakcije, to je komplet bolji.Zašto jeForegene's kit naglašava brzinu, jer oni to dobro znaju.

PS: Neke djevojke vrlo pažljivo izvode eksperimente, ali nisu tako dobri kao zakucavanje nakon nekoliko godina rada.Osjećaju da je Bog nepravedan, žale se na druge i traže život.Zapravo, ona to nije razumjela.Nije dobro zaštitio RNA, a zakucavač je bio spretan.Kad je radio eksperiment, mislio je da će završiti zakucavanje s tri puta, pet puta i dva podjela, ali je eksperiment dobro napravio.

Bilješka: Sporije, veće šanse za invaziju RNaze.Kako se istrenirati da budete brzi?Nema načina, samo više vježbajte.

Za različite pokuse i različite uzorke ipak je potrebno pročitati više literature i odabrati odgovarajuću metodu obrade.Za proces prikupljanja i pohranjivanja uzoraka, MIQE zahtijeva da to mora biti jasno napisano u radu, tako da recenzenti mogu pregledati pouzdanost rada, a također je zgodno za zapanjene mlade da ponove vaš eksperiment.

Iako su biološki eksperimenti teški, oni su vrhunski.Ako niste oprezni, možete preokrenuti svijet.Na primjer, pretvaranje SARS-a u biokemijsku krizu ili pravljenje hibridne riže za spas 1,3 milijarde ljudi.Slika ispod je kemijski eksperiment, trebali biste shvatiti koliko ste ponosni na svoje istraživanje samo gledajući njegov izgled poput kurca.Zaboravi, nemoj ga ocrniti.

MIQE (3) – ekstrakcija nukleinske kiseline.
Ekstrakcija nukleinske kiseline je veliki događaj, a svi eksperimenti molekularne biologije počinju ekstrakcijom nukleinske kiseline.Prije svega, kopirajmo MIQE sadržaj o ekstrakciji nukleinske kiseline.

Gledajući ovu formu, ne možete ostati na površini.Forma je dogma.Da biste bili najbolji student, morate se zapitati zašto.Bitni sadržaj ove tablice je: Potragačistoća, cjelovitost, konzistencija i količina ekstrakcije RNA .

Prvi dioproces ili instrument je korak ekstrakcije nukleinske kiseline.Ako za ekstrakciju koristite automatski ekstraktor nukleinske kiseline (napredno, kontaktirajte me za kupnju), morate navesti naziv modela instrumenta.

Naziv kompleta i

koji je pribor korišten za pojedinosti promjene, koji su posebni reagensi dodani ili koje su posebne operacije učinjene treba jasno objasniti kako bi drugi mogli lako ponoviti vaš eksperiment.

Neki ljudi dodaju posebne reagense prilikom vađenja posebnih uzoraka, misleći da je to njihovo tajno oružje i ne govore drugima.Dok to drže u tajnosti, oni također gube priliku da vaš članak zablista.Ne pametuj, moraš biti pošteniji od seoskog starog Zhanga u znanstvenom istraživanju, ako želiš biti pametan, članak će te učiniti glupim.

mora zapamtiti broj proizvoda kompletakada naručite komplet i napišete članak.Općenito postoje dva broja na kompletu: Cat—kataloški broj (broj proizvoda, broj artikla), Lot—broj serije proizvoda (Koristi se za označavanje iz koje je serije proizvod).

Osim toga, kod naručivanja biokemijskih reagensa često se koristi CAS broj, koji ćemo zajedno popularizirati.CAS broj je broj koji Američko kemijsko društvo dodjeljuje svakom novom kemijskom lijeku.Općenito, tri su broja povezana crticom.Rushuijev CAS broj: 7732-18-5.Kemikalije često imaju više pseudonima, ali CAS broj je jedinstven.Prilikom naručivanja lijeka prvo možete provjeriti njegov CAS broj.

Bliže kući, zašto te stvari moramo jasno opisivati?Zapravo, to je i provjera kvalitete ekstrakcije RNK.Korištenje instrumenata i pribora učinit će ekstrakciju RNK dosljednijom.Razmjer ekstrakcije u običnim laboratorijima nije velik i može se dobiti s priborom.

Pojedinosti o liječenju DNazom ili RNazom
Važno pitanje fluorescentnog kvantitativnog PCR-a je spriječiti kontaminaciju DNK i nemojte eksperimentirati ako postoji kontaminacija.Stoga je imperativ navesti postupak kojim ste obradili DNK, kako biste pokazali da je DNK u eksperimentalnom procesu potpuno i potpuno uklonjena.predstavljena shematskim dijagramom.

Shematski dijagram RNA i DNA
Općenito, metoda za uklanjanje DNA je obrada RNA s DNazom nakon ekstrakcije.Međutim, to su relativno stare metode.Komercijalni kompleti za ekstrakciju RNK uspjeli su ukloniti DNK tijekom procesa ekstrakcije bez dodavanja DNaze.Na primjer, niz kompleta iz Foregene.

Bilješka: Uklanjanje DNK tijekom ekstrakcije RNK vrlo je opasan dvosjekli mač, koji će produljiti vrijeme operacije ekstrakcije RNK i povećati rizik od degradacije RNK.U osnovi, to je kompromis između prinosa RNK i čistoće.

Osim toga, količina DNaze koja se dodaje u adsorpcijsku kolonu na bazi silicijevog dioksida je vrlo mala, a za postizanje učinka mora se koristiti visokokvalitetna DNaza.Neoptimizirana DNaza ne može se brzo i potpuno probaviti.Ovo je test tehničke razine trgovca.Naravno, postoje još čudniji trgovci koji se hvale da se DNK može ukloniti bez DNaze.Može se reći da je huligan svatko tko se hvali da se DNK može potpuno ukloniti bez DNaze.DNK je relativno stabilna dvolančana struktura i ne može se izbrisati samo razgovorom i smijanjem.

Procjena kontaminacije
metoda procjene: detekcija elektroforezom, 1% agaroza, 6V/cm, 15min, punjenje 1-3 ul

Kvantitativna analiza nukleinskih kiselina
obično se mjeri pomoću UV spektrofotometra.Dopustite mi da najprije populariziram značenje triju vrijednosti OD260, OD280 i OD230.
·OD260nm: To je apsorpcijska valna duljina najvećeg apsorpcijskog vrha nukleinske kiseline, a najbolja izmjerena vrijednost kreće se od 0,1 do 1,0.Ako nije, razrijedite ili koncentrirajte uzorak kako bi bio unutar raspona.
·OD280nm: To je valna duljina apsorpcije najvišeg vrha apsorpcije proteina i fenolnih tvari.
·OD230nm: To je valna duljina apsorpcije najvišeg apsorpcijskog vrha ugljikohidrata.

Zatim, razgovarajmo o ulozi svakog pokazatelja.Za A260, može se koristiti za mjerenje prinosa nukleinske kiseline.Kada je OD260=1, dsDNA=50μg/ml, ssDNA=37μg/ml, RNA=40μg/ml.

Za čistoću, moramo pogledati omjere koje obično vidimo: OD260/280 i OD260/230.
· Čista DNK: OD260/280 je približno jednak 1,8.Kada je veći od 1,9, to znači da postoji onečišćenje RNA, a kada je manji od 1,6, to znači da postoji onečišćenje proteinima i fenolima.
· Čista RNA: 1,7
·OD260/230: Bilo da se radi o DNK ili RNK, referentna vrijednost je 2,5.Kada je manji od 2,0, to znači da postoji onečišćenje šećerom, soli i organskim tvarima.

integritet RNA

Vrlo je važno mjeriti integritet RNA.Općenito, potrebno je napraviti eksperiment denaturacije RNA u gelu kako bi se provjerilo je li svjetlina između 28S i 18S RNA dvostruka veza.Kada se pojavi treći pojas 5S, to znači da se RNK počela razgrađivati, osim kod beskralješnjaka.

Podaci za procjenu kvalitete RNA: Osim gore navedenih testova, postoje i neki napredniji instrumentalni testovi u pogledu integriteta RNA, kao što je RQI test integriteta sustava za automatsku elektroforezu Experion, koji može otkriti je li RNA nevidljivo razgrađena.

U znanstvenim istraživanjima, fluorescentni kvantitativni PCR je usporedba između ciljnog gena i internog referentnog gena.Stoga je u procesu očuvanja uzorka RNA, ekstrakcije RNA itd. primarni cilj osigurati integritet RNA.

Kako integritet RNA utječe na ravnotežu između ciljnog gena i internog referentnog gena može se lako razumjeti iz donje slike.Degradacija će dovesti do nepotpunosti gena, bilo da se radi o nepotpunosti internog referentnog gena ili nepotpunosti ciljnog gena, to će imati veliki utjecaj na podatke.

Shematski dijagram ciljnog i referentnog gena ne smije biti istinit

Test inhibicije (je li CT vrijednost potisnuta pod visokom ili niskom koncentracijom ili drugim uvjetima)

Uzimajući ovu sliku kao primjer, Ct vrijednosti pet krivulja su sljedeće.Distribucija CT vrijednosti između krivulja je neravnomjerna, a Ct vrijednosti kasne pod visokim i niskim koncentracijama, što je slučaj PCR inhibicije.

Ključna točka: U procesu ekstrakcije RNK, moramo napustiti zablude i uspostaviti ispravne.

Pogrešna ideja je: ekstrakcija RNA teži samo prinosu, misleći da što je veća količina dobivene RNA, to bolje.Zapravo, kada radimo kvantifikaciju, ako broj gena nije jako velik, ne treba nam puno RNA.Količina RNK koju izdvojite je više nego dovoljna.

Ispravan koncept je:Ekstrakcija RNA treba težiti čistoći, integritetu i dosljednosti.Čistoća može osigurati da naknadna reverzna transkripcija nije inhibirana i da podaci neće biti pod utjecajem DNK.Cjelovitost osigurava ravnotežu ciljnih sekvenci i internih referenci.Konzistentnost osigurava stabilno punjenje uzorka.

MIQE (4) – obrnuti prijepis
Pogrešno shvaćanje: težnja za većim volumenom uzorka.
Ispravan koncept: Težite dosljednosti (stabilnosti), bez obzira na količinu učitane RNA, učinkovitost obrnute transkripcije ostaje dosljedna, osiguravajući da razlike u cDNA mogu doista odražavati razlike u mRNA.
Ovaj proces objašnjavamo shematskim dijagramom:

Shematski dijagram učinkovitosti obrnute transkripcije, nemojte biti istiniti
Prije svega, moramo razumjeti razliku između procesa obrnute transkripcije i PCR procesa.PCR prolazi višestruke procese zagrijavanja i žarenja, a ciljni fragment eksponencijalno raste;dok reverzna transkripcija nema ovaj proces, možemo zamisliti da je reverzna transkripcija zapravo jedan-na-jedan Tijekom procesa replikacije, onoliko dijelova RNA

budući da se može dobiti onoliko dijelova cDNA informacija, to bi do sada trebalo biti shvaćeno, jer su veliki i mali fragmenti obrnuto prepisani, i nemoguće je fokusirati se na jedan fragment.A budući da je količina RNA relativno mala, količina dobivene cDNA je također relativno mala, za razliku od PCR-a, koji ima učinak pojačanja, pa ga je u osnovi nemoguće detektirati.

rezultati cDNA elektroforeze
Drugo, u idealnom slučaju, reverzna transkripcija se izvodi jedan na jedan, ali nijedna reverzna transkriptaza bilo koje tvrtke ne može postići ovaj učinak.U osnovi, učinkovitost većine reverznih transkriptaza kreće se između 30-50%.Ako je to slučaj, radije bismo imali relativno stabilnu učinkovitost obrnute transkripcije, što je ono što želimo vidjeti na slici: 3 RNA dobivaju 2 cDNA, 6 RNA dobivaju 4 cDNA, tako da bez obzira na to koliko je uzoraka učitan, učinkovitost obrnute transkripcije je relativno stabilna.Ne želimo vidjeti situaciju u kojoj je učinkovitost obrnute transkripcije nestabilna, a visoka koncentracija inhibirana.

Dakle, kako provjeriti je li učinkovitost obrnute transkripcije stabilna?Metoda je vrlo jednostavna, trebate samo napraviti usporedni test: jedan je reverzna transkripcija u cDNA nakon udvostručenog razrjeđenja RNA, a drugi je napraviti udvostručeno razrjeđenje nakon reverzne transkripcije u cDNA, a zatim napraviti qPCR da biste vidjeli dobiveni nagib je li dosljedan.Kao vrhunski student, trebali biste to shvatiti za nekoliko sekundi.Kako je prikazano dolje:

Razrjeđivanje RNA i cDNA da se ispita je li učinkovitost reverzne transkripcije stabilna
Reverzna transkriptaza i pribor
Kako savršeni fluorescentni kvantitativni PCR može imati izvrsnu reverznu transkriptazu i komplet.Reverzna transkriptaza se ugrubo dijeli na dvije vrste prema izvoru, AMV iliM-MLV, a njihova izvedba jednaka je onoj prikazanoj u tablici.

aktivnost RNaze H
RNaza H je ribonukleaza H, kineski naziv je ribonukleaza H, koja je endoribonukleaza koja može specifično hidrolizirati RNK u DNA-RNA hibridnom lancu.RNaza H ne može hidrolizirati fosfodiesterske veze u jednolančanoj ili dvolančanoj DNA ili RNA, to jest, ne može probaviti jednolančanu ili dvolančanu DNA ili RNA.Obično se koristi u sintezi drugog lanca cDNA.

Čudna je to stvar.Kažemo da reverzna transkriptaza ima aktivnost RNaze H, a ne da reverzna transkriptaza sadrži RNazu H, i možda neće biti moguće odvojiti RNazu H od reverzne transkriptaze, možda zbog konformacije određenih skupina u reverznoj transkriptazi. Ovu aktivnost uzrokuje reverzna transkriptaza.

Stoga, bez obzira na veću učinkovitost reverzne transkripcije AMV-a, njegova aktivnost RNaze H smanjuje prinos cDNA.Naravno, proizvođači reagensa stalno optimiziraju svoje proizvode kako bi eliminirali aktivnost RNaze H u reverznoj transkriptazi što je više moguće kako bi povećali prinos cDNA.
Temperatura žarenja

Sekundarna struktura RNA pri različitim temperaturama
Pogledajte gornju sliku za sekundarnu strukturu RNA na različitim temperaturama i upotrijebite online alat mFold za određivanje sekundarne strukture ciljnog fragmenta pod određenim uvjetima temperature i koncentracije soli.Na 55°C, sekundarna struktura RNA je još uvijek vrlo složena, reverzna transkriptaza ne može raditi, a sekundarna struktura se ne može potpuno razriješiti do 65°C, dok je optimalna temperatura za AMV i M-MLV daleko niža od te temperature.
Što uraditi?Sekundarna struktura je komplementarno uparivanje samog predloška, ​​što dovodi do jake konkurencije između početnice i reverzne transkriptaze i predloška, ​​što rezultira nizom problema kao što je nizak E i slaba ponovljivost.

Što uraditi?Povećajte samo temperaturu žarenja što je više moguće.

Mnogi proizvođači reagensa poboljšavaju svoju reverznu transkriptazu genetskim inženjeringom.Neki povećavaju temperaturu reakcije, kao što su Jifan i Aidelai, a neki uklanjaju aktivnu skupinu enzima RNaze H kako bi poboljšali afinitet između enzima i RNA uzorka.Visoki afinitet može kompetitivno istisnuti sekundarnu strukturu i glatko čitati, a također uvelike poboljšati učinkovitost obrnute transkripcije.
Ključna točka: Obrnuta transkripcija je važnija za postizanje dosljednosti učinkovitosti obrnute transkripcije (enzimi ne samo da moraju biti učinkoviti nego i stabilni), nego količina unesenog uzorka, ako to nije fluorescentni kvantitativni PCR u velikim razmjerima, uopće neće biti moguć.Višestruke cDNA.
Razni proizvođači također su uložili određene napore u potrazi za dosljednošću.Na primjer, većina tvrtki sada je pakirala obrnutu transkripciju kao standardni komplet za prodaju, što je dobar izbor.
Na primjer, kompleti Foregene RT Easy Series:

RT Easy I (glavni premiks za komplet za sintezu prvog lanca cDNA)

MIQE (5) – informacija o ciljnom genu

Gornja slika objašnjava
1. Je li ovaj gen učinkovit za ponovljene pokuse općenito se može provjeriti ponovljenim pokusima.
2. Gene ID, znate.
3. Duljina gena, ukupna duljina ciljnog gena definitivno nije problem.Prilikom dizajniranja primera, osigurajte da je duljina amplikona između 80-200 bp kako bi se osigurala bolja učinkovitost pojačanja.
4. Informacije o usporedbi sekvence Blast, ciljni gen treba usporediti u banci gena kako bi se spriječilo nespecifično pojačanje.
5. Prisutnost pseudogena.Pseudogen je sekvenca DNK slična normalnom genu, ali gubi svoju normalnu funkciju.Često postoji u višegenskoj obitelji eukariota.Obično se predstavlja s ψ.To je nefunkcionalna kopija genomske DNK u genomu koja je vrlo slična sekvenci kodirajućeg gena., općenito se ne transkribiraju i nemaju jasno fiziološko značenje.
6. Položaj početnica u odnosu na egzone i introne.U ranim godinama, kada smo riješili problem kontaminacije DNK, često smo obraćali pozornost na položaje početnica, egzona i introna i općenito razmatrali dizajniranje početnica preko introna kako bismo izbjegli pojačanje DNK.Molimo pogledajte donju sliku: crna predstavlja introne, razne plave predstavljaju egzone, ružičasta predstavlja uobičajene početnice, a jarko crvena predstavlja početnice koje se protežu na intron.

Shematski, nikad istinito
Kako se ovo čini savršenim planom, ali zapravo, u većini slučajeva, trans-intron početnice nisu tako čarobne kao što se zamišlja, a također će uzrokovati nespecifičnu amplifikacije.Dakle, najbolji način za sprječavanje kontaminacije DNK je potpuno uklanjanje DNK.
7. Predviđanje konformacije.Ponovno koristeći ovaj primjer, upotrijebite online alat mFold za određivanje sekundarne strukture ciljanog fragmenta pri određenoj temperaturi i koncentraciji soli.

Sekundarna struktura RNA pri različitim temperaturama
Sekundarna struktura je komplementarno uparivanje samog predloška, ​​što će dovesti do jake konkurencije između uparivanja početnika i predloška, ​​a šanse za vezanje početnica su manje, što rezultira nizom problema kao što je nizak E i slaba ponovljivost.Kroz softversko predviđanje, ako nema problema sa sekundarnom strukturom, to bi bilo sjajno.Ako postoji, naš sljedeći članak će konkretno raspravljati o tome kako riješiti ovaj problem.

MIQE (6)—qPCR oligonukleotidi

Za fluorescentni kvantitativni PCR, prva stvar s kojom se svakodnevno borite je ekstrakcija RNK, a druga stvar može biti dizajn primera.
Prije svega, još uvijek provjeravamo pravila o dizajnu primera prema MIQE kontrolnoj listi.Toliko je jednostavan da se đubre mogu smijati, a mi ga možemo završiti u jednoj rečenici: saznajte redoslijed i položaj sonde za početnike i način modifikacije.Za metodu pročišćavanja početnica, sinteza početnica je trenutno tako jeftina, qPCR je vrijedan PAGE i više metoda pročišćavanja, a informacije o instrumentu za sintezu nisu važne.Mnogi ljudi rade početnice desetljećima i ne znaju da je sintesajzer ABI3900.
Što se tiče principa dizajna početnica, ne morate ih pamtiti napamet, jer većina softvera za dizajn početnica ili online alata može riješiti ove probleme (preporučeni online alat primer3.ut.ee/), a 99,999% dizajna početnica ne radi se ručno Gledajte, autor ponekad dizajnira stotine početnica dnevno, ako čitate jednu po jednu, postat će kosooki.
Samo provjerite sljedeće točke nakon što su primeri dizajnirani:
1. Dizajnirajte početnice blizu 3' kraja: U slučaju korištenja oligo dT početnica za sintezu prvog lanca cDNA, uzimajući u obzir učinkovitost obrnute transkripcije i integritet RNK, dizajnirane početnice treba dizajnirati blizu 3' kraja kako bi se poboljšala učinkovitost amplifikacije.Koristite sliku da objasnite kako slijedi (ne postoji način da se ovo shvati):

Zašto bi primeri trebali biti dizajnirani blizu 3′ kraja, to ne mora biti istina
2. TM vrijednost: Tm vrijednost je na 55-65°C (jer je aktivnost egzonukleaze najveća na 60°C), a GC sadržaj je na 40%-60%.
3. BLAST: Kako bi se izbjegla nespecifična amplifikacija genoma, Blast se mora koristiti za dodatnu verifikaciju.

MIQE(7)—qPCR proces

1. qPCR komplet
Prema zahtjevima MIQE-a, u članku moramo jasno opisati kompletne uvjete reakcije, uključujući konfiguraciju sustava PCR reakcije, koji se kit koristi, tko je proizvođač, koliko je velik reakcijski sustav, koristi li se metoda bojanja ili metoda sonde, postavke PCR programa.Vozači veterani će definitivno otkriti da sve dok je kit odabran, gore navedene informacije su u osnovi određene.
Trenutno je proizvodnja i proizvodnja fluorescentnih kvantitativnih PCR kompleta vrlo zrela tehnologija.Sve dok ne odaberete izrazito loše proizvođače, vjerojatnost problema nije velika, ali ipak želimo s vama podijeliti nekoliko točaka:
Taq enzim vrućeg pokretanja:Najvažniji dio PCR-a je Taq enzim za vrući početak.Hot-start enzimi na tržištu općenito se dijele u dvije vrste, jedan je kemijski modificirani hot-start enzim (možete ga zamisliti kao ugradnju u parafin), a drugi je hot-start enzim za modifikaciju antitijela (vezivanje antigen-antitijelo).Kemijska modifikacija je rani način pokretanja enzima na vrućem.Kada se postigne određena temperatura, enzim će otpustiti svoju aktivnost.Enzim vrućeg pokretanja modificiran antitijelima koristi biološke metode za blokiranje aktivnosti enzima.Kada se postigne određena temperatura, antitijelo će biti denaturirano i deaktivirano kao protein, a aktivnost enzima će se uključiti.

Međutim, koja je korist od ovoga?To je slučaj, aktivnost otpuštanja enzima modificiranih antitijelima je brža od aktivnosti kemijski modificiranih enzima, tako da u smislu osjetljivosti enzimi modificirani antitijelima imaju blagu prednost, tako da u kompletima na tržištu praktično nema kemijski modificiranih enzima.Ako postoji, onda je tehnologija ovog proizvođača još uvijek zapela u eri tisućljeća.
Koncentracija magnezijevih iona:Koncentracija magnezijevih iona vrlo je važna u PCR reakciji.Odgovarajuća koncentracija iona magnezija može potaknuti oslobađanje aktivnosti Taq enzima.Ako je koncentracija preniska, aktivnost enzima bit će znatno smanjena;ako je koncentracija previsoka, pojačat će se enzimom katalizirano nespecifično pojačanje.Koncentracija magnezijevih iona također će utjecati na žarenje početnica, temperaturu taljenja predloška i PCR proizvoda, čime će utjecati na prinos umnoženih fragmenata.Koncentracija magnezijevih iona općenito se kontrolira na 25 mM.Naravno, za dobar komplet, koncentracija magnezijevih iona mora biti dobro kontrolirana.Neki trgovci reagensu dodaju sredstvo za keliranje magnezijevih iona, čime se može postići učinak automatske prilagodbe koncentracije magnezijevih iona.
Koncentracija fluorescentne boje:Fluorescentna boja, koja je SYBR Green koju obično koristimo, uglavnom stvara fluorescenciju vezanjem na manji žlijeb dvolančane DNK, jer je vezanje boje na dvolančanu DNK nespecifično, to jest sve dok se dvolančana DNK kombinira s njom, može doći do fluorescencije, tako da će se primeri-dimeri i DNK predlošci u sustavu kombinirati s njom kako bi formirali pozadinski signal .
PS: Zbog svojih svojstava osjetljivosti na svjetlo, proizvodi na tržištu općenito su pakirani u smeđe neprozirne epruvete za centrifugiranje (kao što je prikazano na slici ispod).Međutim, to će naići na problem.Teško je vidjeti da li je tekućina usisana prilikom uzorkovanja.U tom pogledu Qingke je doista najlakši za korištenje (kao što je prikazano na slici ispod), a prozirna tuba pakirana je u neprozirnu limenu vrećicu.Zatim ga stavite u limenu vrećicu, vodeći računa o praktičnosti izbjegavanja svjetla i uzorkovanja.Morate odabrati pravi broj proizvoda.TSE204 je super isplativa egzistencija, koja me tjera da posadim travu.

Koncentracija fluorescentne boje također je vrlo važna.Ako je koncentracija preniska, krivulja pojačanja neće ići gore u kasnijoj fazi i nije savršena;ako je koncentracija previsoka, uzrokovat će smetnje.Budući da fluorescentni kvantitativni PCR uglavnom ovisi o CT vrijednosti, ako koncentracija fluorescentne boje nije ispravno podešena, niska točka je bolja od visoke točke.Naravno, odgovarajuća koncentracija boje je najbolja.

ROX: ROX boje se koriste za ispravljanje pogrešaka fluorescencijskog signala od jažice do jažice.Neki proizvođači instrumenata zahtijevaju kalibraciju, dok drugi ne.Na primjer, korištenje Thermo Fisher Scientific's Real Time PCR instrumenta za amplificiranje obično zahtijeva kalibraciju, uključujući 7300, 7500, 7500Fast, StepOnePlus, itd. Općenite upute za komplet to će opisati.
Foregene's qPCR Mix također sadrži ROX boju, koja je prikladna za korištenje u različitim modelima.

Real Time PCR Kit-Taqman

Obrada slabe vodikove veze: Tretman slabih vodikovih veza je relativno tehnička stvar.Ništa nije pročitao priručnike mnogih kompleta, ali nitko od njih nije spomenuo ovu temu.Zapravo, toliko je važno.Kombinacija baza uglavnom ovisi o jakosti vodikovih veza.Jake vodikove veze su normalno pojačanje, a slabe vodikove veze dovode do nespecifičnog pojačanja.Ako se slabe vodikove veze ne mogu dobro eliminirati, nespecifično pojačanje se ne može izbjeći.U okviru autora samo je nekoliko tvrtki uočilo ovaj problem.Kada kupujete komplet, možete se pozabaviti jeste li razmatrali rješenje u tom pogledu za komplet koji želite odabrati.

Volumen reakcije: Sustav od 20-50 ul se češće koristi, a manje količine vjerojatno će uzrokovati pogreške.Općenito govoreći, upute za kit će preporučiti korištenje PCR reakcijskih volumena.Ne budite pametni i koristite manje količine kako biste uštedjeli na troškovima.cilj od.Količina koju preporučuju trgovci zapravo je testirana i moguće je da oni ne mogu riješiti problem pogrešaka uzrokovanih malim količinama.
2. Proizvođač i broj artikla ploče cijevi
Svima je poznat princip fluorescentne kvantitativne PCR.Prikupljanje fluorescencije uglavnom se provodi preko PCR epruveta.Prilikom odabira PCR potrošnog materijala obratite pozornost na dvije točke: dobar prijenos svjetlosti i pogodnost za instrument.Općenito govoreći, ploče i cijevi mainstream marki su u redu, ali morate pažljivo birati u smislu prilagodbe, inače nećete moći koristiti instrument.

4. Vrhunsko znanje

MIQE (8)—qPCR validacija
Ovo je glavni prioritet qPCR-a!Toliko je heroja ovdje palo u pijesak.Naravno, moguće je i da imate sreće i da su geni koje ste proučavali jednostavni pa ste plutali kroz ledenu špilju uz vjetar.Informacije o provjeri qPCR-a namijenjene su testiranju pouzdanosti podataka.Navodimo potrebne podatke za provjeru kako slijedi:

1. Test specifičnosti
Specifičnost amplifikacije ciljnog gena testira se provjerom je li slika elektroforeze jednostruka traka;provjera sekvenciranja;krivulja topljenja da se vidi je li mapa vrha jednostruka;verifikacija probave enzima i druge metode.
Ovdje se fokusiramo na tanaliza nespecifičnog pojačanja metodom krivulja taljenja.Općenito govoreći, kada dizajniramo primere, veličina fragmenta proizvoda mora biti u rasponu od 80-200 bp, što čini temperaturu taljenja PCR proizvoda u rasponu od 80-85 °C.Stoga, ako postoje različiti pikovi, moraju postojati i drugi nespecifični produkti pojačanja;ako se vrh pojavi ispod 80°C, općenito se smatra da je početni dimer;ako se vrhunac pojavi iznad 85°C, općenito se smatra da je riječ o kontaminaciji DNA ili više nespecifičnom amplificiranju velikih fragmenata.
Napomena: ponekad postoji samo jedan vrh na 80°C.U ovom trenutku treba se pridržavati ovog koncepta.Vjerojatno je da su svi rezultati amplifikacije početni dimeri.

Normalna krivulja taljenja (jedan vrh bez nespecifičnog pojačanja)

Problematična krivulja taljenja (nespecifično pojačanje lažnih vrhova)
【Analiza slučaja】

Postoji glavni vrh, ali početni dimer je ozbiljan
Krivulja taljenja s jednim vrhom na donjoj slici može lako zavarati vaše oči, misleći da je to savršen eksperiment, ali rezultat je potpuno pogrešan.U ovom trenutku moramo pogledati temperaturu taljenja.Vršna temperatura je ispod 80°C, što je potpuno temeljni dimer.

Nema ciljanog fragmenta, svi početni dimeri
Evo, moj brat ne može stati.Na slici ispod je fotka slikana mobitelom koju mi ​​je poslao jedan ološ.Svi reagensi koje je koristio su marke koje se uobičajeno koriste u industriji.Promijenio je s jedne marke s prefiksom T na drugu marku s prefiksom T.Mislim da ste već pogodili.Ološ mi je povikao: “Reagens korišten na prvoj slici je predobar, a vrh je jedan.Kasnije, nakon korištenja reagensa koji ste preporučili, postaje kao na drugoj slici, s miješanim vrhovima.Učinio si me jadnom.“
Odvojite dva grafa.Na prvi pogled jedan ima jednostruki, a drugi dvostruki vrh.Glupost, jedan vrh je naravno u redu.Je li to istina?
Gore nego Dou E, ako stavim dvije slike na sliku ispod, odmah ćete shvatiti.Zapravo, lako smo paralizirani ovakvom slikom.Nakon pažljive analize, otkrili smo da: vrh prve brojke je na 75°C, što je potpuno početni dimer;vrhunac druge brojke pojavljuje se na 75°C i 82°C, barem postoje Proizvod se pojavljuje.

Slike povratnih informacija učenika
Dakle, temeljni problem nije problem reagensa, već problem dizajna primera.U isto vrijeme, to također dokazuje da neke velike robne marke nisu kvalitetne željeza, a također dokazuje ono što je moj brat prije rekao: Nije marka reagensa ono što podupire vaš članak.Vaš je članak podupro marku reagensa.Zamislite samo, da nitkov nije promijenio reagense, pogrešni podaci bili bi poslani u časopis, a ono što bi se dogodilo bila bi tragedija.
2. Ct vrijednost slijepe kontrole
Nemojte objašnjavati, ako prazna kontrola ima Ct vrijednost, nije li to zagađenje?Međutim, i dalje morate razumjeti koja prazna kontrola ima Ct vrijednost.Ako je NTC, to znači da postoji strana DNK kao što je kontaminacija reagensa.Ako je NRT, to znači da ekstrahirana RNA ima kontaminaciju DNA.
3. Standardna krivulja
Uključujući nagib i formulu za izračun, učinkovitost PCR-a može se izračunati pomoću formule.Savršen eksperiment zahtijeva da se nagib standardne krivulje približi 3,32, a R² da se približi 0,9999.
4. Linearni dinamički raspon
Dinamički raspon reakcije je linearan.Prema predlošku korištenom za generiranje standardne krivulje, dinamički raspon treba uključivati ​​najmanje 5 koncentracijskih gradijenata, a obratiti pozornost na promjenu vrijednosti Ct pri visokim i niskim koncentracijskim gradijentima.
5. Točnost detekcije
Promjene u rezultatima qPCR-a, odnosno loša ponovljivost, odnosno loša preciznost, uzrokovani su mnogim čimbenicima, uključujući temperaturu, koncentraciju i rad.Preciznost qPCR općenito postaje manje kontrolirana kako se broj kopija smanjuje.U idealnom slučaju unutar eksperimentalne varijacije, ova tehnička varijacija trebala bi se razlikovati od biološke varijacije, a biološki replikati mogu izravno utjecati na statističke razlike u rezultatima qPCR-a između skupina ili tretmana.Osobito za dijagnostičke testove, mora se prijaviti najbolja preciznost između testova (ponovljivost) za mjesta i operatere.
6. Učinkovitost detekcije i LOD (u multipleksnoj qPCR)
LOD je najniža koncentracija od 95% otkrivenih pozitivnih uzoraka.Drugim riječima, koncentracija LOD sadržana u skupu replikata ciljnog gena ne bi smjela premašiti 5% neuspjelih reakcija.Kada se radi multipleksna qPCR analiza, posebno za istovremeno otkrivanje točkastih mutacija ili polimorfizama, multipleksna qPCR treba pružiti dokaz da točnost više ciljnih fragmenata nije ugrožena u istoj epruveti, višestruka detekcija i detekcija u jednoj epruveti. Učinkovitost i LOD trebaju biti isti.Pogotovo kada se ciljni geni visoke koncentracije i ciljani geni niske koncentracije istovremeno amplificiraju, ovom se problemu mora posvetiti pozornost.
Problemi i rješenjaOpćenito govoreći, problemi koji se često susreću u otklanjanju pogrešaka qPCR-a fokusiraju se na sljedeće aspekte:
·nespecifična amplifikacija
·Težak izbor koncentracije primera i problemi s primer-dimerima
· Temperatura žarenja je netočna
·Sekundarna struktura utječe na učinkovitost pojačanja
nespecifična amplifikacija
nespecifična amplifikacijadogodi, općenito se razmatra je li dizajn temeljnog premaza neprikladni, ali ako vam se ne žuri mijenjati temeljni premaz, prvo možete isprobati sljedeće metode (princip je također priložen):
· Povećajte temperaturu žarenja – pokušajte učiniti da se slabe vodikove veze ne mogu održati;
·Skratite vrijeme žarenja i elongacije – smanjite mogućnost slabih vodikovih veza;
·Smanjite koncentraciju početnica – smanjite mogućnost vezanja suvišnih početnica i neciljanih regija;
Niska učinkovitost pojačanja
Situacija suprotna od nespecifičnog pojačanja – niska učinkovitost pojačanja, a mjere za rješavanje problema niske učinkovitosti pojačanja upravo su suprotne:
·Produžiti vrijeme žarenja i elongacije;
·Promjena na PCR u tri koraka i smanjenje temperature žarenja;
·Povećajte koncentraciju temeljnog premaza;
Ps: Mnogi diplomirani studenti rođeni 90-ih nisu voljni učiti kako ispravljati pogreške u eksperimentima i nadaju se da kit može u potpunosti riješiti problem (ako želite ići u tvrtku za reagense radi istraživanja i razvoja nakon diplome), zapravo, proizvođači reagensa također razmišljaju na ovaj način, nadam se da je glupo. Može se koristiti kada ga dobijete, tako da su proizvođači reagensa uložili mnogo truda da riješe problem nespecifičnog pojačanja, uključujući uvođenje slabog H-bona d faktori apsorpcije.Da bi lako riješili problem, budale još uvijek moraju pročitati uvod tvrtke reagensa da vide postoji li faktor koji apsorbira slabe vodikove veze.
Težak izbor koncentracije primera i problemi s primer-dimerima
Metoda 1: Općenito govoreći, upute za komplet za qPCR sadrže preporučene sustave i preporučene koncentracije početnica.
Metoda 2: Otklanjanje pogrešaka postavljanjem gradijenta koncentracije temeljnog premaza.Slika ispod je ukradena iz tvrtke za ilustraciju.Donja slika prikazuje kvantitativne rezultate fluorescencije dobivene s tri gradijenta koncentracije primera (100 nM, 250 nM, 500 nM) i četiri gradijenta koncentracije uzorka (0,1 ng, 1 ng, 10 ng, 100 ng).Vrijednost Ct eksperimentalnih rezultata prikazana je na sljedeći način:

Odabir koncentracije primera Spojite svaku koncentraciju primera u red na sljedeći način:

Izbor koncentracije primera je očit, linearni odnos koncentracije primera od 100 nM i 250 nM je bolji, a linearni odnos koncentracije primera od 500 nM je relativno loš.U 100nM i 250nM, Ct vrijednost od 250nM je relativno mala, tako da je optimalna koncentracija primera 250nM.Općenito, na krivulji taljenja mogu se vidjeti ozbiljni početni dimeri.Što ako dizajnirani primeri ne mogu izbjeći primer-dimere?
Metoda 3: Smanjite količinu temeljnih premaza i povećajte temperaturu žarenja (nema potrebe objašnjavati).
Empirijska vrijednost temperature žarenja je 60°C.Ako niste sigurni, kako odabrati prikladniju temperaturu žarenja?Odgovor je isti kao i izbor koncentracije primera –test gradijenta.Uzmite sliku tvrtke Bio-rad da ilustrirate problem.Za pojačanje određenog ciljnog fragmenta postaviti osam temperaturnih gradijenata, svaki s tri ponavljanja, a dobivena krivulja pojačanja je sljedeća:

odabir temperature žarenja:
·70°C, 69°C—U osnovi, početnice se ne mogu kombinirati, tako da nema pojačanja.
·67,3°C – Postoji mala količina pojačanja na početku, a vrijednost Ct je relativno velika.
·64,5°C——Ct vrijednost se smanjuje.
·Na 60,7°C, 58,0°C, 56,2°C i 55,0°C, vrijednosti Ct uglavnom su bile stabilne, ali konačne vrijednosti fluorescencije bile su različite.
Kako odabrati?Princip: Prvi princip je veća vrijednost Ct.Za istu vrijednost Ct odaberite višu temperaturu žarenja kako biste izbjegli dimerizaciju i nespecifično pojačanje.Iako postoji viša vrijednost fluorescencije na 55°C, u njoj mogu postojati dimeri ili nespecifično pojačanje.
Ali ako ste pametni poput vas, sigurno ćete pomisliti: Logično govoreći, ako je PCR reakcija vrlo specifična, sve dok koncentracija primera premašuje minimalne zahtjeve, visoke i niske točke ne bi trebale imati učinka, baš kao fluorescentne boje i dNTP.Doista, sve dok je temperatura žarenja pravilno optimizirana, učinak koncentracije primera na Ct vrijednost prirodno će biti minimiziran.

Temperatura žarenja je pravilno optimizirana, a učinak koncentracije primera na CT bit će sveden na minimum
Sekundarna struktura utječe na učinkovitost pojačanja
Uzmimo sliku iz Bio-rada da ilustriramo problem.Također dizajnira temperaturni gradijent za pojačavanje gena sa sekundarnom strukturom.

Pojavljuje se sekundarna struktura
Može se vidjeti da kako se temperaturni gradijent smanjuje, produkti se počinju pojavljivati ​​i vrijednost Ct se pomiče naprijed, dostižući minimalnu vrijednost na 60,7°C, a zatim kako se temperaturni gradijent smanjuje, vrijednost Ct postaje veća.Suprotno tome, kako temperatura raste, sekundarna struktura se otvara i povećava se učinkovitost pojačanja.Nakon postizanja određene temperature, povećanje temperature ne može poboljšati učinkovitost pojačanja.Budući da se početnice u ovom trenutku ne mogu stabilno kombinirati.Stoga,potražite temperaturu s najnižom vrijednošću Ct, što je najbolja temperatura za pojačavanje predloška sekundarne strukture!Naravno, pametne budale moraju znati da je, ako nije potrebno, najbolje promijeniti primere i izbjegavati regiju sekundarne strukture.
5. Razina primjene
MIQE—Analiza podataka

Analiza podataka uglavnom se daje fluorescentnim kvantitativnim PCR instrumentom.U prethodnom članku obavljeno je mnogo posla na analizi podataka, kao što je prazna kontrola, što je objašnjeno u dizajnu eksperimenta.Interni referentni geni, brojevi ponavljanja, itd. su razjašnjeni., ovdje uglavnom objašnjavamo primjenu qPCR-a.
qPCR se široko koristi, a eksperimentalna verifikacija i dijagnoza nukleinske kiseline najčešće su korišteni scenariji.
apsolutna kvantifikacija
Log (početna koncentracija) ima linearan odnos s brojem ciklusa.Standardna krivulja može se nacrtati iz standarda s poznatim početnim brojem kopija, to jest, može se dobiti linearni odnos reakcije pojačanja.Prema Ct vrijednosti uzorka može se izračunati koncentracija u uzorku.Količina predložaka koje treba uključiti.

Metoda apsolutnog kvantitativnog izračuna
Apsolutna kvantifikacija mora se temeljiti na standardnoj krivulji.Za izradu standardne krivulje potreban je standard.Obično je standard plazmid dobiven kloniranjem ciljnog gena.Zašto je to plazmid?Budući da je kružna plazmidna DNA najstabilnija.Standardni proizvod razrijedite u 5 do 6 gradijenata u skladu s omjerom udvostručenja (10-struko razrjeđenje) i pri razrjeđivanju obratite pažnju na ujednačenost.Neka vrijednost Ct padne između 15-30.

Standardna priprema
U isto vrijeme, uzorak koji se ispituje treba također razrijediti u skladu s tim (zapamtite faktor razrjeđenja), a vrijednost Ct također treba biti između 15-30.Standardni proizvod + uzorak koji se ispituje zajedno se stavljaju na stroj.Nakon ciklusa, napravljena je standardna krivulja sa standardnom tvari, a uzorci za ispitivanje dovedeni su u standardnu ​​krivulju za izračunavanje koncentracije.
Kvantifikacija HBV virusa hepatitisa B tipična je apsolutna kvantifikacija, kojom se može izračunati broj kopija virusa u 1 ml krvi.
Izračun broja kopija
Koncentracija uzorka za ispitivanje (ng/ul) = OD260 × 50ug/ml × faktor razrjeđenja
Molekularna težina uzorka = broj baza × 324
Broj primjeraka uzorka koji se ispituje (kopija/ul) = koncentracija uzorka koji se ispituje / molekularna težina uzorka × 6 × 1014

Metoda izračuna broja kopija

Gore navedena je metoda izračuna za određivanje količine.Ovo je matematički problem koji se može riješiti nakon završene srednje škole, a matematički problemi uglavnom se rješavaju pomoću računala.Ako ne razumijete, možete doći komunicirati.
relativna kvantifikacija
Relativna kvantifikacija se uglavnom koristi u znanstvenim istraživanjima.Koliko virusa ima u 1ml krvi, a radi se o DNA virusu, to je relativno deterministički događaj: može se odrediti količina krvi, a DNA virus je relativno stabilan.Međutim, teško nam je usporediti broj kopija transkripcije određenog gena u listu, jer je teško odrediti veličinu, težinu i nježnost lista, količinu ekstrahirane RNA je teško odrediti, a učinkovitost obrnute transkripcije je također teško odrediti, to jest, bilo koji korak može učiniti da eksperimentalni podaci imaju greške i ne mogu se koristiti.
Stoga relativna kvantifikacija mora uvesti element:unutarnji referentni gen.
Drugim riječima, relativna kvantifikacija zapravo je usporedba između ciljnog gena i internog referentnog gena.U usporedbi s istim tkivom i istom stanicom, utjecaj veličine uzorka, količine ekstrakcije RNA, učinkovitosti obrnute transkripcije i učinkovitosti PCR-a relativno je mali.Zbog male veličine uzorka, i interni referentni geni i ciljni geni bili su relativno smanjeni.Zato smo i prije naglašavali uniformnost i stabilnost.
Unutarnji referentni geni općenito sugeni domaćinstva(house-keeping genes), koji se odnosi na klasu gena koji se stabilno izražavaju u svim stanicama, a njihovi produkti su neophodni za održavanje osnovnih životnih aktivnosti stanica.
Nemojte brkati ovaj koncept.Geni domaćinstva su izrazi biološke funkcije, dok su interni referentni geni eksperimentalni tehnički pojmovi.Geni domaćinstva moraju proći validaciju prije nego što se mogu odabrati kao interni referentni geni.
Na primjer, odabrali smo nekoliko gena za domaćinstvo na donjoj slici kako bismo testirali njihovu razinu ekspresije u različitim stanicama tkiva i otkrili da su razine ekspresije β-2-mikroglobulina prilično različite od onih ostala tri gena, tako da se ne mogu koristiti kao interni referentni geni.

Nakon razumijevanja funkcije korekcije internog referentnog gena, izvedena su dva algoritma zbog uvođenja internog referentnog gena.
·metoda dvostruke standardne krivulje
·2 – △△Ct metoda (metoda usporedbe CT vrijednosti)
Ako ste zainteresirani za proučavanje vrsta i funkcija gena, molimo vas da odustanete od istraživanja algoritama i izravno koristite formule ili izravno koristite strojeve;ako ste iskren tip u matematici i inženjerstvu, slobodno.
metoda dvostruke standardne krivulje
Kvantificirajte ciljni gen i gen za domaćinstvo kontrolnog uzorka i uzorka koji se testira putem standardne krivulje, a zatim izračunajte relativnu vrijednost prema formuli za izračun, što je relativna razina ekspresije.
Prednosti: jednostavna analiza, relativno jednostavna eksperimentalna optimizacija
Nedostatak: Za svaki gen, svaka runda eksperimenata mora napraviti standardnu ​​krivulju
Primjena: Jedna od dvije najčešće korištene i priznate relativne kvantitativne metode u proučavanju regulacije ekspresije gena
Formula je sljedeća:

Primjeri su sljedeći:

Izračunajte relativnu količinu na temelju kvantitativnog rezultata
2 – △△Ct metoda (CT metoda usporedbe vrijednosti)

Prednosti: Nema potrebe za izradom standardne krivulje
Nedostaci: Pretpostavlja se da je učinkovitost pojačanja blizu 100%;standardna devijacija je < 5%, a pretpostavlja se da su standardna krivulja i učinkovitost između svakog pojačanja dosljedne;optimizacija eksperimentalnih uvjeta je kompliciranija.
Primjena: Jedna od dvije najčešće korištene i priznate relativne kvantitativne metode u proučavanju regulacije ekspresije gena

Naravno, učinkovitost pojačanja obično je nemoguće biti savršena 1. Metoda korekcije: Ako znamo da ciljni gen i referentni gen imaju istu učinkovitost pojačanja, ali učinkovitost pojačanja nije jednaka 1, tada se 2－△△Ct može ispraviti kao: (1+E )－△△Ct, na primjer, ako je učinkovitost pojačanja 0,95, tada se formula za izračun može ispraviti na 1,9 5－△△Ct
Do sada je došao kraj sadržaju o fluorescentnom kvantitativnom PCR-u.