Objašnjenje osnovnih pojmova molekularne biologije
1. cDNA i cccDNA: cDNA je dvolančana DNA sintetizirana reverznom transkriptazom iz mRNA;cccDNA je plazmidna dvolančana zatvorena kružna DNA slobodna od kromosoma.
2. Standardna sklopiva jedinica: sekundarna strukturna jedinica proteina α-heliks i β-list mogu formirati strukturne blokove s posebnim geometrijskim rasporedom putem različitih povezujućih polipeptida.Ova vrsta determiniranog savijanja obično se naziva super sekundarna struktura.Gotovo sve tercijarne strukture mogu se opisati ovim tipovima nabora, pa čak i njihovim kombiniranim tipovima, pa se nazivaju i standardnim nabornim jedinicama.
3. CAP: ciklički adenozin monofosfat (cAMP) receptorski protein CRP (cAMP receptorski protein), kompleks nastao nakon kombinacije cAMP i CRP naziva se aktivirajući protein CAP (cAMP aktivirani protein)
4. Palindromski slijed: Reverzni komplementarni slijed segmenta fragmenta DNA, često mjesto restrikcijskog enzima.
5. micRNA: komplementarna interferirajuća RNA ili antisense RNA, koja je komplementarna sekvenci mRNA i može inhibirati translaciju mRNA.
6. Ribozim: RNA s katalitičkom aktivnošću, koja ima autokatalitičku ulogu u procesu spajanja RNA.
7. Motiv: Postoje neka lokalna područja sličnog trodimenzionalnog oblika i topologije u prostornoj strukturi proteinskih molekula.
8. Signalni peptid: peptid s 15-36 aminokiselinskih ostataka na N-terminusu tijekom sinteze proteina, koji vodi transmembranu proteina.
9. Attenuator: Nukleotidni slijed između operatorske regije i strukturnog gena koji završava transkripciju.
10. Čarobna točka: Kada bakterija raste i naiđe na potpuni nedostatak aminokiselina, bakterija će proizvesti hitan odgovor kako bi zaustavila ekspresiju svih gena.Signali koji generiraju ovaj hitni odgovor su guanozin tetrafosfat (ppGpp) i guanozin pentafosfat (pppGpp).Uloga PpGpp-a i pppGpp-a nije samo jedan ili nekoliko operona, već djeluju na veliki broj njih, pa se nazivaju superregulatorima ili čarobnim točkama.
11. Upstream promotorski element: odnosi se na sekvencu DNA koja igra regulatornu ulogu u aktivnosti promotora, kao što je TATA u regiji -10, TGACA u regiji -35, pojačivači i atenuatori.
12. DNA sonda: označeni segment DNA s poznatim slijedom, koji se naširoko koristi za detekciju nepoznatih sekvenci i provjeru ciljnih gena.
13. SD sekvenca: To je vezna sekvenca ribosoma i mRNA, koja regulira translaciju.
14. Monoklonsko protutijelo: protutijelo koje djeluje samo protiv jedne antigene determinante.
15. Kozmid: To je umjetno konstruiran egzogeni DNA vektor koji zadržava COS regije na oba kraja faga i povezan je s plazmidom.
16. Probir plavo-bijele mrlje: LacZ gen (koji kodira β-galaktozidazu), enzim može razgraditi kromogeni supstrat X-gal (5-bromo-4-kloro-3-indol-β-D-galaktozid) da proizvede plavu boju, čime soj postaje plav.Kada se umetne egzogena DNA, gen LacZ se ne može eksprimirati, a soj je bijele boje, kako bi se pregledale rekombinantne bakterije.To se zove plavo-bijeli ekran.
17. Cis-djelujući element: Specifična sekvenca baza u DNK koja regulira ekspresiju gena.
18. Klenow enzim: Veliki fragment DNA polimeraze I, osim što je aktivnost 5' 3' egzonukleaze uklonjena iz holoenzima DNA polimeraze I
19. Usidren PCR: koristi se za umnožavanje DNK od interesa s poznatom sekvencom na jednom kraju.Poli-dG rep dodan je na jedan kraj nepoznate sekvence, a zatim su poli-dC i poznata sekvenca korišteni kao početnice za PCR amplifikaciju.
20. Fuzijski protein: Gen eukariotskog proteina povezan je s egzogenim genom, a protein sastavljen od translacije originalnog gena proteina i egzogenog proteina se eksprimira istovremeno.
Ostali pojmovi molekularne biologije
1. Fizička mapa DNA je redoslijed kojim su raspoređeni (probavljeni restrikcijskom endonukleazom) fragmenti molekule DNA.
2. Cijepanje RNaze dijeli se na dva tipa (autokataliza) i (heterokataliza).
3. Tri su inicijacijska faktora kod prokariota (IF-1), (IF-2) i (IF-3).
4. Transmembranski proteini zahtijevaju usmjeravanje (signalni peptidi), a uloga proteinskih šaperona je (pomaže u savijanju peptidnog lanca u nativnu konformaciju proteina).
5. Elementi u promotorima općenito se mogu podijeliti u dvije vrste: (osnovni promotorski elementi) i (uzvodni promotorski elementi).
6. Istraživački sadržaj molekularne biologije uglavnom uključuje tri dijela: (strukturna molekularna biologija), (ekspresija i regulacija gena) i (tehnologija rekombinacije DNA).
7. Dva ključna eksperimenta koji pokazuju da je DNK genetski materijal su (infekcija miševa pneumokokom) i (infekcija T2 fagom Escherichie coli).potencijal).
8. Postoje dvije glavne razlike između hnRNA i mRNA: (hnRNA je spojena u procesu pretvaranja u mRNA), (5' kraj mRNA je dodan s m7pGppp kapom, a postoji dodatna poliadenilacija na 3' kraju kiselinskog (polyA) repa mRNA).
9. Prednosti oblika proteina s više podjedinica su (podjedinica je ekonomična metoda za iskorištavanje DNA), (može smanjiti utjecaj slučajnih pogrešaka u sintezi proteina na aktivnost proteina), (aktivnost se može vrlo učinkovito i brzo otvarati i zatvarati).
10. Glavni sadržaj mehanizma savijanja proteina prva teorija nukleacije uključuje (nukleaciju), (strukturno obogaćivanje), (konačno preuređenje).
11. Galaktoza ima dvostruko djelovanje na bakterije;s jedne strane (može se koristiti kao izvor ugljika za rast stanica);s druge strane (također je sastavni dio stanične stijenke).Stoga je cAMP-CRP-neovisan promotor S2 potreban za trajnu sintezu na razini pozadine;u isto vrijeme, cAMP-CRP-ovisan promotor S1 je potreban za regulaciju sinteze na visokoj razini.Transkripcija počinje od (S2) s G i od (S1) bez G.
12. Tehnologija rekombinantne DNA poznata je i kao (kloniranje gena) ili (molekularno kloniranje).Konačni cilj je (prijenos genetske informacije DNK iz jednog organizma u drugi organizam).Tipični eksperiment rekombinacije DNA obično uključuje sljedeće korake: (1) Izdvojite ciljni gen (ili egzogeni gen) organizma donora i enzimski ga povežite s drugom molekulom DNA (vektor za kloniranje) kako biste formirali novu molekulu rekombinantne DNA.② Molekula rekombinantne DNA prenosi se u stanicu primatelja i replicira u stanici primatelja.Taj se proces naziva transformacija.③ Pregledajte i identificirajte one stanice primateljice koje su apsorbirale rekombinantnu DNK.④Uzgojite stanice koje sadrže rekombinantnu DNK u velikim količinama kako biste otkrili je li izražen gen strane pomoći.
13. Postoje dvije vrste replikacije plazmida: one koje su strogo kontrolirane sintezom proteina stanice domaćina nazivaju se (tijesni plazmidi), a one koje nisu strogo kontrolirane sintezom proteina stanice domaćina nazivaju se (opušteni plazmidi).
14. Sustav PCR reakcije trebao bi imati sljedeće uvjete: a.DNA početnice (oko 20 baza) s komplementarnim sekvencama na svakom kraju dvaju lanaca ciljnog gena koje treba odvojiti.b.Enzimi s toplinskom stabilnošću kao što su: TagDNA polimeraza.c, dNTPd, sekvenca DNA od interesa kao predložak
15. Osnovni reakcijski proces PCR-a uključuje tri faze: (denaturacija), (žarenje) i (ekstenzija).
16. Osnovni proces transgenih životinja obično uključuje: ①Uvođenje kloniranog stranog gena u jezgru oplođene jajne stanice ili embrionalne matične stanice;②Transplantacija inokuliranog oplođenog jajašca ili embrionalne matične stanice u žensku maternicu;③Kompletan embrionalni razvoj i rast Za potomstvo sa stranim genima;④ Koristite ove životinje koje mogu proizvesti strane proteine kao rasplodnu stoku za uzgoj novih homozigotnih linija.
17. Stanične linije hibridoma nastaju hibridizacijom stanica (slezene B) sa stanicama (mijeloma), a budući da (stanice slezene) mogu iskoristiti hipoksantin i (stanice kostiju) osigurati funkcije stanične diobe, mogu se uzgajati u HAT mediju.rasti.
18. Produbljivanjem istraživanja prva generacija antitijela naziva se (poliklonska antitijela), druga generacija (monoklonska antitijela), a treća generacija (genetski inženjering antitijela).
19. Trenutačno je genetski inženjering virusa insekata uglavnom usmjeren na bakulovirus, što se očituje u uvođenju (egzogeni toksin gena);(geni koji remete normalan životni ciklus insekata);(modifikacija virusnih gena).
20. Transaktivni proteinski faktori koji odgovaraju zajedničkim elementima TATA, GC i CAAT u promotoru RNA polimeraze II sisavaca su (TFIID), (SP-1) odnosno (CTF/NF1).
dvadeset i jedan.Osnovni transkripcijski faktori RNA polimeraze Ⅱ su, TFⅡ-A, TFⅡ-B, TFII-D, TFⅡ-E, a njihov vezni niz je: (D, A, B, E).Pri čemu je funkcija TFII-D (vezivanje na TATA okvir).
dvadeset i dva.Većina transkripcijskih čimbenika koji se vežu na DNK djeluju u obliku dimera.Funkcionalne domene transkripcijskih faktora koji se vežu na DNA obično su sljedeće (helix-turn-helix), (motiv cinkovog prsta), (bazični-leucin) motiv patentnog zatvarača).
dvadeset tri.Postoje tri vrste načina cijepanja restrikcijske endonukleaze: (rezanje na 5' strani osi simetrije za stvaranje 5' ljepljivih krajeva), (rezanje na 3' strani osi simetrije za stvaranje 3' ljepljivih krajeva (rezanje na osi simetrije za stvaranje ravnih segmenata) ).
dvadeset i četiri.Plazmidna DNA ima tri različite konfiguracije: (SC konfiguracija), (oc konfiguracija), (L konfiguracija).Prvi u elektroforezi je (SC konfiguracija).
25. Egzogeni sustavi ekspresije gena, uglavnom (Escherichia coli), (kvasac), (kukac) i (tablica stanica sisavaca).
26. Često korištene metode za transgene životinje su: (metoda retrovirusne infekcije), (metoda mikroinjekcije DNA), (metoda embrionalnih matičnih stanica).
Primjena Molekularna biologija
1. Navedite funkcije više od 5 RNA?
Prijenosna RNA tRNA Prijenosna aminokiselina Ribosomska RNA rRNA Ribosom čini glasničku RNA mRNA Predložak za sintezu proteina Heterogena nuklearna RNA hnRNA Prekursor zrele mRNA mala nuklearna RNA snRNA Uključena u spajanje hnRNA Mala citoplazmatska RNA scRNA/7SL-RNA protein Plazma retikulum lokaliziran i sintetiziran za prepoznavanje signala komponente tijela Antisens RNA anRNA/micRNA Regulira ekspresiju gena Ribozyme RNA Enzimski aktivna RNA
2. Koja je glavna razlika između prokariotskih i eukariotskih promotora?
Prokariotski TTGACA --- TATAAT------Inicijalno mjesto-35 -10 Eukariotski pojačivač---GC ---CAAT----TATAA-5mGpp-Inicijalno mjesto-110 -70 -25
3. Koji su glavni aspekti umjetne konstrukcije prirodnih plazmida?
Prirodni plazmidi često imaju defekte, pa nisu prikladni za korištenje kao nosači za genetski inženjering, te se moraju modificirati i konstruirati: a.Dodajte odgovarajuće gene markera selekcije, kao što su dva ili više, koji se lako koriste za selekciju, obično antibiotske gene.b.Povećajte ili smanjite prikladna mjesta rezanja enzima kako biste olakšali rekombinaciju.c.Skratite duljinu, odrežite nepotrebne dijelove, poboljšajte učinkovitost uvoza i povećajte nosivost.d.Promijenite replikon, iz čvrstog u labav, s manje kopija na više kopija.e.Dodajte posebne genetske elemente prema posebnim zahtjevima genetskog inženjeringa
4. Navedite primjer metode diferencijalnog probira tkivno specifične cDNA?
Pripreme se dvije stanične populacije, ciljni gen je eksprimiran ili visoko eksprimiran u jednoj od stanica, a ciljni gen nije eksprimiran ili je slabo eksprimiran u drugoj stanici, a zatim se ciljani gen pronađe hibridizacijom i usporedbom.Na primjer, tijekom pojave i razvoja tumora, tumorske stanice će prezentirati mRNA s različitim razinama ekspresije od normalnih stanica.Stoga se geni povezani s tumorom mogu izdvojiti diferencijalnom hibridizacijom.Metoda indukcije također se može koristiti za izdvajanje gena čija je ekspresija inducirana.
5. Generiranje i probir staničnih linija hibridoma?
B stanice slezene + stanice mijeloma, dodajte polietilen glikol (PEG) za promicanje spajanja stanica, a fuzijske stanice B-mijeloma slezene uzgojene u HAT mediju (koji sadrži hipoksantin, aminopterin, T) nastavljaju se širiti i hraniti.Stanična fuzija sadrži: stanice slezene i slezene: ne mogu rasti, stanice slezene ne mogu se uzgajati in vitro.Stanice fuzije kostiju i kostiju: ne mogu iskoristiti hipoksantin, ali mogu sintetizirati purin kroz drugi put pomoću folat reduktaze.Aminopterin inhibira folat reduktazu i stoga ne može rasti.Stanice fuzije kosti i slezene: mogu rasti u HAT-u, stanice slezene mogu koristiti hipoksantin, a koštane stanice osiguravaju funkciju diobe stanica.
6. Koji je princip i metoda određivanja primarne strukture DNA metodom dideoksi terminalne terminacije (Sangerova metoda)?
Načelo je korištenje terminatora nukleotidnog lanca—2,,3,-dideoksinukleotida za prekid produžetka DNK.Budući da mu nedostaje 3-OH potreban za stvaranje 3/5/fosfodiesterskih veza, jednom kada se ugradi u lanac DNA, lanac DNA ne može se dalje produžiti.Prema načelu sparivanja baza, kad god DNA polimeraza treba dNMP da sudjeluje u normalno produženom lancu DNA, postoje dvije mogućnosti, jedna je da sudjeluje u ddNTP, što rezultira prekidom produžetka deoksinukleotidnog lanca;drugi je sudjelovanje u dNTP-u, tako da se DNA lanac može produžiti dok se sljedeći ddNTP ne ugradi.Prema ovoj metodi može se dobiti skupina fragmenata DNA različitih duljina koji završavaju na ddNTP.Metoda je podijeliti u četiri skupine redom ddAMP, ddGMP, ddCMP i ddTMP.Nakon reakcije, elektroforezom na poliakrilamidnom gelu može se očitati sekvenca DNK prema gumicama za plivanje.
7. Kakav je pozitivan regulacijski učinak proteina aktivatora (CAP) na transkripciju?
Ciklički adenilat (cAMP) receptorski protein CRP (cAMP receptorski protein), kompleks formiran kombinacijom cAMP i CRP naziva se CAP (cAMP aktivirani protein).Kada se E. coli uzgaja u mediju bez glukoze, povećava se sinteza CAP-a, a CAP ima funkciju aktiviranja promotora kao što je laktoza (Lac).Neki promotori ovisni o CRP-u nemaju tipičnu značajku sekvence regije -35 (TTGACA) koju imaju uobičajeni promotori.Stoga se RNK polimeraza teško veže na njega.Prisutnost CAP (funkcija): može značajno poboljšati konstantu vezanja enzima i promotora.Uglavnom prikazuje sljedeća dva aspekta: ① CAP pomaže molekuli enzima da se ispravno orijentira mijenjajući konformaciju promotora i interakciju s enzimom, tako da se kombinira s regijom -10 i igra ulogu zamjene funkcije regije -35.②CAP također može inhibirati vezanje RNA polimeraze na druga mjesta u DNA, povećavajući tako vjerojatnost vezanja na svoj specifični promotor.
8. Koji su koraci obično uključeni u tipični eksperiment rekombinacije DNA?
a.Ekstrahirajte ciljni gen (ili egzogeni gen) organizma donora i enzimski ga povežite s drugom molekulom DNA (vektor za kloniranje) kako biste formirali novu molekulu rekombinantne DNA.b.Prenesite rekombinantnu molekulu DNA u stanicu primatelja te je replicirajte i sačuvajte u stanici primatelju.Taj se proces naziva transformacija.c.Pregledajte i identificirajte one stanice primateljice koje su apsorbirale rekombinantnu DNA.d.Masovna kultura stanica koje sadrže rekombinantnu DNA kako bi se otkrilo je li izražen gen strane pomoći.
9. Konstrukcija genske biblioteke Dane su tri metode za pretraživanje rekombinanata i ukratko je opisan postupak.
Probir rezistencije na antibiotike, insercijska inaktivacija rezistencije, probir plavo-bijele mrlje ili PCR probir, diferencijalni probir, DNA sonda Većina vektora za kloniranje nosi gene otpornosti na antibiotike (anti-ampicilin, tetraciklin).Kada se plazmid prenese u Escherichiu coli, bakterije će steći rezistenciju, a one bez transfera neće imati rezistenciju.Ali ne može razlikovati je li reorganizirano ili ne.U vektoru koji sadrži dva gena za rezistenciju, ako je fragment strane DNA umetnut u jedan od gena i uzrokuje inaktivaciju gena, dvije kontrole na pločici koje sadrže različite lijekove mogu se koristiti za pretraživanje pozitivnih rekombinanata.Na primjer, plazmid pUC sadrži gen LacZ (koji kodira β-galaktozidazu), koji može razgraditi kromogeni supstrat X-gal (5-bromo-4-kloro-3-indol-β-D-galaktozid) da proizvede plavu boju, čime soj postaje plavi.Kada se umetne strana DNK, LacZ gen se ne može eksprimirati, a soj je bijele boje, kako bi se pregledale rekombinantne bakterije.
10. Objasnite osnovni postupak dobivanja transgenih životinja putem embrionalnih matičnih stanica?
Embrionalne matične stanice (ES) su embrionalne stanice tijekom embrionalnog razvoja, koje se mogu umjetno uzgajati i razmnožavati te imaju funkciju diferencijacije u druge vrste stanica.Kultura ES stanica: unutarnja stanična masa blastociste se izolira i uzgaja.Kada se ES uzgaja u sloju bez hranilice, on će se diferencirati u različite funkcionalne stanice kao što su mišićne stanice i N stanice.Kada se uzgaja u mediju koji sadrži fibroblaste, ES će održati funkciju diferencijacije.ES se može genetski manipulirati, a njegova funkcija diferencijacije može se integrirati bez utjecaja na njegovu funkciju diferencijacije, što rješava problem slučajne integracije.Uvesti egzogene gene u embrionalne matične stanice, zatim implantirati u maternicu trudnih ženki miševa, razviti u mladunce i križati kako bi dobili homozigotne miševe.
