Dobro je poznato da je u središnjoj dogmi RNA transkripcijski posrednik između DNA i ekspresije proteina.U usporedbi s detekcijom DNA, detekcija RNA može objektivnije odražavati ekspresiju gena u organizmima.Eksperimenti koji uključuju RNA uključuju: qRT-PCR, RNA-Seq i detekciju fuzijskog gena, itd. Na temelju karakteristika same RNA (šećerni prsten RNA ima jednu slobodnu hidroksilnu skupinu više od šećernog prstena DNA), zajedno s velikim brojem RNaza u okolišu, RNA je nestabilnija i lakše se razgrađuje od DNA.Smeće unutra, smeće van, ako kvaliteta RNA nije dobra, onda eksperimentalni rezultati moraju biti nezadovoljavajući, konkretno se očituju kao netočni podaci ili loša ponovljivost.Stoga treba više pozornosti posvetiti obradi RNA, a važnija je i veza kontrole kvalitete kako bi se osigurala preciznost i točnost naknadnih eksperimentalnih podataka.

Za kontrolu kvalitete RNA općenito se koriste sljedeće metode:

• Spektrofotometrija
• elektroforeza u agaroznom gelu
• Bioanalizator Agilent
• fluorescentni kvantitativni PCR u stvarnom vremenu
• Metoda Qubit fluorescentne boje

01 Spektrofotometrija

RNA ima konjugirane dvostruke veze i ima maksimum apsorpcije na valnoj duljini od 260 nm.Prema Lambert-Beerovom zakonu, možemo izračunati koncentraciju RNA iz apsorpcijskog pika na 260 nm.Osim toga, možemo također izračunati čistoću RNA prema omjeru apsorpcijskih vrhova od 260 nm, 280 nm i 230 nm.280 nm i 230 nm su vrhovi apsorpcije proteina, odnosno malih molekula.Omjer A260/A280 i A260/A230 kvalificirane čistoće RNA trebao bi biti veći od 2. Ako je manji od 2, to znači da u uzorku RNA postoji kontaminacija proteinom ili malim molekulama i treba ga ponovno pročistiti.Izvori kontaminacije utjecat će na nizvodne eksperimente, kao što je inhibicija učinkovitosti pojačanja PCR reakcija, što će rezultirati netočnim kvantitativnim rezultatima.Čistoća RNA ima veliki utjecaj na naknadne rezultate, pa je spektrofotometrija općenito neizostavna karika kontrole kvalitete u prvom koraku u eksperimentima s nukleinskim kiselinama.

Slika 1. Tipični RNA/DNA apsorpcijski spektar

02 Elektroforeza u agaroznom gelu

Osim čistoće, integritet RNA također je jedan od važnih pokazatelja za procjenu kvalitete RNA.Razgradnja RNK dovest će do velikog broja kratkih fragmenata u uzorku, tako da će se broj fragmenata RNK koji se mogu učinkovito otkriti i pokriti referentnom sekvencom smanjiti.Integritet RNA može se provjeriti elektroforezom ukupne RNA na 1% agaroznom gelu.Ovom metodom možete sami konfigurirati gel ili koristiti gotov E-Gel™ sustav za testiranje integriteta.Više od 80% ukupne RNA je ribosomska RNA, od koje se većina sastoji od 28S i 18S rRNA (u sustavima sisavaca).RNK dobre kvalitete pokazat će dvije očigledne svijetle trake, koje su svijetle trake 28S i 18S, na 5 Kb i 2 Kb, a omjer će biti blizu 2:1.Ako je u difuznom stanju, to znači da je uzorak RNA možda degradiran, te se preporuča korištenje kasnije opisane metode za daljnje ispitivanje kvalitete RNA.

Slika 2. Usporedba degradirane (linija 2) i intaktne RNA (linija 3) na elektroforezi u agaroznom gelu

03 Bioanalizator Agilent

Uz gore opisanu metodu elektroforeze u agaroznom gelu, koja nam može pomoći da jednostavno i brzo identificiramo integritet RNA, također možemo koristiti Agilent bioanalizator za određivanje integriteta RNA.Koristi kombinaciju mikrofluidike, kapilarne elektroforeze i fluorescencije za procjenu koncentracije i cjelovitosti RNK.Korištenjem ugrađenog algoritma za analizu profila uzorka RNA, bioanalizator Agilent može izračunati referentnu vrijednost integriteta RNA, broj integriteta RNA (u daljnjem tekstu RIN) [1].Što je veća vrijednost RIN-a, veći je integritet RNA (1 je izrazito degradiran, 10 je najpotpuniji).Neki eksperimenti koji uključuju RNA predlažu korištenje RIN-a kao parametra za procjenu kvalitete.Uzimajući eksperimente sekvenciranja visoke propusnosti (u daljnjem tekstu NGS) kao primjer, smjernice Oncomine™ Human Immune Repertoire, koji se koristi za otkrivanje receptora antigena B stanica i T stanica u Thermo Fisherovoj Oncomine seriji panela, sugeriraju da se uzorci s RIN vrijednostima većim od 4, mogu mjeriti učinkovitija očitavanja i klonovi (Slika 3).Postoje različiti preporučeni rasponi za različite ploče, a često veći RIN može donijeti učinkovitije podatke.

Slika 3, u Oncomine™ eksperimentima ljudskog imunološkog repertoara, uzorci s RIN većim od 4 mogu detektirati učinkovitija očitavanja i klonove T stanica.【2】

Međutim, RIN vrijednost također ima neka ograničenja.Iako RIN ima visoku korelaciju s kvalitetom NGS eksperimentalnih podataka, nije prikladan za FFPE uzorke.Uzorci FFPE kemijski su tretirani dugo vremena, a ekstrahirana RNA općenito ima relativno nisku RIN vrijednost.Međutim, to ne znači da učinkoviti podaci eksperimenta moraju biti nezadovoljavajući.Kako bismo točno procijenili kvalitetu FFPE uzoraka, moramo koristiti mjerenja koja nisu RIN.Uz RIN, Agilent bioanalizator također može izračunati DV200 vrijednost kao parametar procjene kvalitete RNA.DV200 je parametar koji izračunava udio fragmenata većih od 200 bp u uzorku RNA.DV200 je bolji pokazatelj kvalitete FFPE uzorka od RIN-a.Za RNA ekstrahiranu FFPE-om, ona ima vrlo visoku korelaciju s brojem gena koji se mogu učinkovito detektirati i raznolikošću gena [3].Iako DV200 može nadoknaditi nedostatke u detekciji kvalitete FFPE, bioanalizator Agilent još uvijek ne može sveobuhvatno analizirati probleme kvalitete u uzorcima RNA, uključujući i to postoje li inhibitori u uzorcima.Sami inhibitori mogu utjecati na učinkovitost pojačanja nizvodnih eksperimenata i smanjiti količinu korisnih podataka.Kako bismo znali postoji li inhibitor u uzorku, možemo usvojiti fluorescentnu kvantitativnu PCR metodu u stvarnom vremenu koja je opisana u nastavku.

04 fluorescentni kvantitativni PCR u stvarnom vremenu

Fluorescentna kvantitativna PCR metoda u stvarnom vremenu ne samo da može detektirati inhibitore u uzorku, već i točno odražavati kvalitetu RNA u FFPE uzorku.U usporedbi s Agilent biološkim analizatorima, kvantitativni instrumenti fluorescencije u stvarnom vremenu popularniji su u velikim biološkim laboratorijima zbog svoje šire primjene.Da bismo testirali kvalitetu uzoraka RNA, samo trebamo kupiti ili pripremiti primere sonde za unutarnje referentne gene, kao što je GUSB (kataloški br. Hs00939627).Upotrebom ovog skupa početnica, sondi i standarda (ukupna RNA poznate koncentracije) za provođenje apsolutnih kvantitativnih eksperimenata, efektivna koncentracija fragmenta RNA može se izračunati kao standard za procjenu kvalitete RNA (skraćeno Functional RNA Quantitation (FRQ)).U NGS testu otkrili smo da FRQ uzoraka RNA ima vrlo visoku korelaciju s efektivnom količinom podataka.Za sve uzorke veće od 0,2 ng/uL FRQ, najmanje 70% očitanja može učinkovito pokriti referentnu sekvencu (Slika 4).

Na slici 4, vrijednost FRQ otkrivena kvantitativnom metodom fluorescencije ima vrlo visoku korelaciju (R2>0,9) s efektivnim podacima dobivenim u NGS eksperimentu.Crvena linija je vrijednost FRQ jednaka 0,2 ng/uL (log10 = -0,7).【4】

Osim što je primjenjiva na FFPE uzorke, kvantitativna PCR metoda u stvarnom vremenu također može učinkovito pratiti inhibitore u uzorcima.Možemo dodati uzorak koji treba detektirati u reakcijski sustav s internom pozitivnom kontrolom (IPC) i njegovim testom, a zatim izvršiti kvantifikaciju fluorescencije kako bismo dobili vrijednost Ct.Ako vrijednost Ct zaostaje za vrijednošću Ct u reakciji bez uzorka, to znači da je inhibitor prisutan u uzorku i inhibira učinkovitost pojačanja u reakciji.

05 Metoda Qubit fluorescentne boje

Qubit Fluorometar je najčešće korišteni mali uređaj za detekciju koncentracije i čistoće nukleinskih kiselina, koji je jednostavan za rukovanje i postoji u gotovo svakom laboratoriju za molekularnu biologiju.Točno izračunava koncentraciju nukleinske kiseline detekcijom i fluorescentnom bojom koja veže nukleinsku kiselinu (reagens za detekciju Qubit).Qubit ima visoku osjetljivost i specifičnost i može točno kvantificirati RNA do koncentracije pg/µL.Uz dobro poznatu sposobnost točne kvantifikacije koncentracije nukleinske kiseline, najnoviji novi model tvrtke Thermo Fisher, Qubit 4.0, također može otkriti integritet RNA.Qubit 4.0 sustav za otkrivanje RNK (RNA IQ Assay) detektira integritet RNK istovremenim otkrivanjem dvije specifične fluorescentne boje.Ove dvije fluorescentne boje mogu se vezati za velike i male fragmente RNK.Ove dvije fluorescentne boje pokazuju udio velikih fragmenata RNA u uzorku, a iz toga se može izračunati IQ (Integrity and Quality) vrijednost koja predstavlja kvalitetu RNA.IQ vrijednost primjenjiva je i na FFPE i na ne-FFPE uzorke i ima veliki utjecaj na kasniju kvalitetu sekvenciranja.Uzimajući NGS eksperimente kao primjer, u eksperimentima RNA-Seq testa izvedenim na Ion torrent™ platformi, većina uzoraka s IQ vrijednostima većim od 4 imala je najmanje 50% učinkovitih očitanja (Slika 5).U usporedbi s gore navedenim metodama detekcije, Qubit IQ test ne samo da je praktičniji za rukovanje i traje manje vremena (unutar pet minuta), već također ima veliku korelaciju između izmjerene vrijednosti parametra IQ i kvalitete podataka nizvodnih eksperimenata.

Slika 5, postoji velika korelacija između vrijednosti Qubit RNA IQ i mapiranih očitanja RNA-Seq.【5】

Kroz gornji uvod, vjerujem da svatko dovoljno razumije različite metode kontrole kvalitete RNK.U praksi, možete biratiodgovarajuću metodu prema vrsti uzorka i postojećim instrumentima.Samo dobrom kontrolom kvalitete RNA možemo izbjeći neuspjeh naknadnih eksperimenata uzrokovan lošom kvalitetom uzorka, štedeći tako dragocjeno vrijeme, energiju i troškove.

Referentni proizvodi:

Komplet za izolaciju ukupne životinjske RNK

Cell Total RNA Isolation Kit

reference

【1】Schroeder, A., Mueller, O., Stocker, S. et al.RIN: broj integriteta RNK za dodjeljivanje vrijednosti integriteta mjerenjima RNK.BMC Molecular Biol 7, 3 (2006).https:// doi .org/10.1186/1471-21 99-7-3

【2】Korisnički vodič Oncomine Human Immune Repertoire (Pub. br. MAN0017438 Rev. C.0).

【3】Leah C Wehmas, Charles E Wood, Brian N Chorley, Carole L Yauk, Gail M Nelson, Susan D Hester, Enhanced Quality Metrics for Assessing RNA Derived From Archival Formalin-Fixed Paraffin-Embedded Tissue Samples, Toxicological Sciences, svezak 170, izdanje 2, kolovoz 2019., stranice 357 –373,https://doi.org/10.1093/toxsci/