Mi smo iskusni proizvođač.Osvojiti većinu u ključnim certifikatima svog tržišta za velike popuste Kina Visoko osjetljiva sonda u jednom koraku Rt-QpcrKit V2, Kvaliteta je život tvornice, Usredotočenost na potražnju kupaca je izvor opstanka i razvoja tvrtke, Pridržavamo se poštenja i dobre vjere u radu, veselimo se vašem dolasku!
Mi smo iskusni proizvođač.Osvojiti većinu u ključnim certifikatima svog tržišta zaChina Taq DNA polimeraza, Qpcr, Naša tvrtka obećava: razumne cijene, kratko vrijeme proizvodnje i zadovoljavajuću uslugu nakon prodaje, također vas pozdravljamo da posjetite našu tvornicu kad god želite.Želimo da sada imamo ugodan i dugotrajan zajednički posao!!!

Opisi

Ovaj komplet koristi jedinstveni sustav pufera za lizu koji može brzo osloboditi RNA iz uzgojenih staničnih uzoraka za RT-qPCR reakcije, čime se eliminira dugotrajan i težak proces pročišćavanja RNA.Predložak RNA može se dobiti za samo 7 minuta.5×Direct RT Mix i 2×Direct qPCR Mix-SYBR reagensi koji se nalaze u kompletu mogu brzo i učinkovito dobiti kvantitativne rezultate PCR-a u stvarnom vremenu.

5×Direct RT Mix i 2×Direct qPCR Mix-SYBR imaju jaku toleranciju na inhibitore, a lizat uzoraka može se izravno koristiti kao obrazac za RT-qPCR.Ovaj komplet sadrži jedinstvenu Foregene reverznu transkriptazu visokog afiniteta RNA i Hot D-Taq DNA polimerazu, dNTP, MgCl₂, reakcijski pufer, PCR optimizator i stabilizator.

Tehnički podaci

200×20μl Rxns, 1000×20μl Rxns

Komponente kompleta

Značajke i prednosti

■ Jednostavno i učinkovito: s tehnologijom Cell Direct RT, uzorci RNA mogu se dobiti za samo 7 minuta.

■ Potreba za uzorkom je mala, može se testirati samo 10 stanica.

■ Visoka propusnost: može brzo detektirati RNA u stanicama uzgojenim u pločama s 384, 96, 24, 12, 6 jažica.

■ DNA Eraser može brzo ukloniti oslobođene genome, uvelike smanjiti utjecaj na naknadne eksperimentalne rezultate.

■ Optimizirani RT i qPCR sustav čini RT-PCR reverznu transkripciju u dva koraka učinkovitijom, a PCR specifičnijom i otpornijom na inhibitore RT-qPCR reakcije.

Primjena kompleta

Područje primjene: kultivirane stanice.

- RNA oslobođena lizom uzorka: primjenjivo samo na RT-qPCR predložak ovog kompleta.

- Komplet se može koristiti u sljedeće svrhe: analiza ekspresije gena, verifikacija učinka utišavanja gena posredovanog siRNA, probir lijekova itd.

Dijagram

Skladištenje i rok trajanja

Dio I ovog pribora treba čuvati na 4 ℃;Dio II treba čuvati na -20 ℃.

Foregene Protease Plus II treba čuvati na 4 ℃, ne zamrzavati na -20 ℃.

Reagens 2×Direct qPCR Mix-SYBR treba čuvati na -20 ℃ u mraku;ako se često koristi, također se može pohraniti na 4 ℃ za kratkotrajno skladištenje (iskoristiti unutar 10 dana). Mi smo iskusni proizvođač.Osvojiti većinu u ključnim certifikatima svog tržišta za veliki popust Kina Visokoosjetljiva sonda u jednom koraku Rt-Qpcr Kit V2, Kvaliteta je tvornički život, Fokus na potražnju kupaca je izvor opstanka i razvoja tvrtke, Pridržavamo se iskrenosti i dobronamjernog radnog stava, veselimo se vašem dolasku!
Veliko sniženjeChina Taq DNA polimeraza, Qpcr, Naša tvrtka obećava: razumne cijene, kratko vrijeme proizvodnje i zadovoljavajuću uslugu nakon prodaje, također vam želimo da posjetite našu tvornicu kad god želite.Želimo da sada imamo ugodan i dugotrajan zajednički posao!!!

QuickEasyTM Cell Direct RT-qPCR Kit -Taqman

Kat.br.DRT-01021/01022

Za stanični izravni RT-qPCR pomoću ≤ 1000 000 stanica

Predstavljanje proizvoda

Ovaj proizvod koristi jedinstveni sustav pufera za lizu za brzo oslobađanje RNA iz uzgojenih staničnih uzoraka za RT-qPCR reakcije, eliminirajući dugotrajan i mukotrpan proces pročišćavanja RNA, i samo 7 minuta za dobivanje potrebne RNA šablone, uz 5× Direct RT Mix, 2× Direct qPCR Mix-Taqman koji se isporučuje u kompletu može brzo i učinkovito dobiti kvantitativne PCR rezultate u stvarnom vremenu.

5× Direct RT Mix i 2× Direct qPCR Mix-Taqman imaju snažnu toleranciju na inhibitore i mogu izvesti učinkovito poništavanje i specifično pojačanje koristeći lizat uzorka koji se mjeri kao predložak.Reagens sadrži Foregene reverznu transkriptazu, Hot D-Taq DNA polimerazu, dNTP, MgCl₂, Reaction Buffer, PCR Optimizer and Stabilizer, koji se može koristiti s puferom za lizu za brzo i jednostavno otkrivanje uzoraka, a ima karakteristike visoke osjetljivosti, specifičnosti i stabilnosti.

Značajke proizvoda

Jednostavna, učinkovita tehnologija Cell Direct RT kojoj je potrebno samo 7 minuta za dobivanje uzoraka RNA.

Zahtjevi za uzorke su mali, a za eksperimentiranje se može koristiti najmanje 10 uzgojenih stanica.

Visoka propusnost za brzo dobivanje RNK kultiviranih stanica kao što su ploče s 384, 96, 24, 12 i 6 jažica.

DNA Eraser može brzo ukloniti oslobođene genome, uvelike smanjujući utjecaj na naknadne eksperimentalne rezultate.

Optimizirani RT i qPCR sustavi omogućuju RT-PCR u dva koraka s učinkovitijom reverznom transkripcijom, specifičnošću i jačom tolerancijom inhibitora RT-qPCR reakcije.

Primjena kompleta

Područje primjene: Kultivirane stanice.

RNA interpretirana lizom uzorka: koristi se samo kao predložak RT-qPCR u dva koraka.

Kompleti se mogu koristiti u sljedeće svrhe: analiza genske regulacije ekspresije, testiranje alela, probir lijekova itd.

Ograničenja kompleta

Amplificirani fragmenti ≤ 300 bp.

Kompleti se koriste za svježe uzgoj stanica.

Kontrola kvalitete proizvoda

Prema FOREGENE-ovom sustavu upravljanja potpunom kvalitetom, svaka serija kompleta Cell Direct RT-qPCR serije je rigorozno testirana više puta kako bi se osigurala pouzdanost i stabilnost kvalitete svake serije kompleta.

Sadržaj kompleta

*:Cell Lysis, 5×Direct RT Mix, 2× Direct qPCR Mix-Taqman mogu se kupiti zasebno, detalji su navedeni u Dodatku 1 (STRANICA 13).

Uvjeti skladištenja

1. Uvjeti otpreme

Cijeli proces transporta kutije s paketom leda na niskoj temperaturi, kako bi se osiguralo da je komplet u stanju <4 °C.

2. Uvjeti skladištenja

Čuvati dio I na 4°C, a dio II na -20°C.

Foregene Protease Plus II treba čuvati na 4°C, ne zamrzavati na -20°C.

Reagens 2× Direct qPCR Mix-Taqman čuva se na -20°C ili na 4°C za kratkotrajnu upotrebu ako se često koristi (u roku od 10 dana).

Informacije o komponentama kompleta

Pufer CL: Pruža okruženje potrebno za reakcije lize stanica.

Pufer ST: prekida aktivnu tvar u lizatu kako bi se izbjegli učinci na naknadnu RT.

DNA Eraser: sredstvo za uklanjanje DNK, učinak uklanjanja genoma na naknadne eksperimente.

5× Direct RT Mix: Sadrži Foregene reverznu transkriptazu visokog RNA afiniteta, inhibitor RNase, dNTP, stabilizatore, pojačivače, optimizatore i primere reverzne transkripcije za optimalno poravnanje (Random Primer, Oligo(dT)₁₈Primer).

Foregene Protease Plus II: U kontekstu pufera za lizu, stanice se liziraju kako bi otpustile nukleinske kiseline.

2× Direct qPCR Mix-Taqman: Ovaj reagens sadrži vruću D-Taq DNA polimerazu, dNTP, MgCl₂, reakcijski pufer, PCR optimizator i stabilizator.

20× ROX referentna boja: općenito se koristi na instrumentima za pojačavanje PCR u stvarnom vremenu tvrtki ABI, Stratagene i drugih tvrtki, koristi se za podešavanje razlike između PCR epruveta i epruveta uzrokovanih pogreškama u doziranju PCR.Koncentracija 20× ROX Reference Dye potrebna za različite instrumente je različita, a korisnik je može dodati prema preporučenoj koncentraciji instrumenta.

ddH bez RNaze₂O: Sterilizirana ultra čista voda bez RNaze za RT-qPCR reakcije u dva koraka.

Mjere predostrožnosti:(Svakako pažljivo pročitajte mjere opreza prije korištenja kompleta)

Obratite pozornost na metodu rada eksperimenta kako biste izbjegli unakrsnu kontaminaciju između uzoraka.

Obratite pozornost na čistoću eksperimentalnog okoliša i posuđa kako biste izbjegli kontaminaciju RNazom i degradaciju RNK.

Uzmite svježe ili dobro očuvane uzorke stanica i nikada ne koristite ponovljene uzorke stanica zamrznutih i odmrznutih.

5× Direct qPCR Mix, 2× Direct qPCR Mix-Taqman bi trebao izbjegavati opetovano zamrzavanje-otapanje, inače će utjecati na obrnutu transkripciju i učinkovitost PCR-a.

Prepaobrociprijeoperacija

Pažljivo pročitajte upute prije korištenja ovog kompleta.Cell Direct RT-qPCR Kit je jednostavan, praktičan i brz za rukovanje, a upute pružaju potpune informacije o cijelom kompletu i kako ga pravilno koristiti.Prije upotrebe pripremite potrebne eksperimentalne materijale i opremu.

Eksperimentalni materijali i oprema

◆ Kultura stanica.

◆ 1,5 ml ili 2 ml, epruveta za centrifugiranje bez RNaze/DNaze, vrh bez RNaze/DNaze, sterilna qPCR epruveta od 0,2 ml.

◆ qPCR stroj, pipeta, stolna centrifuga (≥13 400×g) (ovisno o eksperimentalnim potrebama) itd.

Sigurnost

◆ Ovaj proizvod je samo u svrhe znanstvenog istraživanja, nemojte ga koristiti u farmaceutske, kliničke, prehrambene i kozmetičke svrhe.

◆ Kada koristite kemikalije, nosite odgovarajuću laboratorijsku odjeću, rukavice, zaštitne naočale itd.

Operacijavodiči

Sustavi za lizu stanica, RT sustavi i dodatni paketi qPCR reakcijske otopine mogu se kupiti zasebno, za detalje u Dodatku 1 (STRANICA 13).

Vodič za rad

O: Otpuštanje uzorka RNK

1. Stanice su prethodno obrađene: isperite ploču sa staničnom kulturom hladnim PBS-om, zatim lizirajte stanice (10-10⁶), 10⁶ od količine stanica, preporučuje se Foregene the Cell an RNA Isolation Kit the Total (DE-03111) ili Animal Total RNA Isolation Kit (DE-03011) za ekstrakciju i pročišćavanje RNA.

1.1.Prilijepljene stanice (ploča s 24 jažice kao primjer)

1.1.1.Odredite broj stanica u svakoj jažici, odredite da je broj stanica 1 × 10⁵, i pomoću pipete uklonite medij kulture iz posude s kulturom.

1.1.2.Dodajte 200 μl prethodno ohlađenog 1 × PBS-a u svaku jažicu.Nemojte pipetirati više puta i uklonite PBS iz jažica.Nagnite ploču i uklonite što više PBS-a.Prijeđite na korak 2.

1.1.3.Različita posuda za kulturu stanica ili tablica referentnog broja 1-1 u zdjelu za kulturu stanica dodana je prethodno ohlađena 1 × PBS za ispiranje stanica.

Tablica 1-1: Doziranje PBS-a za različite brojeve stanica

Bilješka:Kako bi se osiguralo čvrsto prianjanje stanica，veliki broj gubitaka stanica izbjegnut prilikom pranja.

1.2.Stanice u suspenziji ili adherentne stanice uzgajane u neporoznim pločama

1.2.1.Prilijepljene stanice uzgojene u pločicama bez više jažica (suspenzijske stanice počinju od sljedećeg koraka 1.2.2), prikupiti i odvojiti stanice u skladu s uobičajenom metodom prikupljanja stanica i staviti ih u ploču s kulturom ili epruvetu centrifuge;ako se koristi tripsinizacija, potrebno je centrifugiranje za prikupljanje stanica i uklanjanje zaostalog tripsina, dodane PBS resuspendirane stanice u pojedinačne stanice kako bi se stanice raspršile.

1.2.2.Nakon broja izbrojanih stanica, alikvoti stanica 1×10⁵ jedan u epruvete za centrifugiranje, sakupite stanice centrifugiranjem na 1000 × g tijekom 10 minuta.

1.2.3.Dodajte 200 μl PBS u epruvetu centrifuge, nemojte ponovno pipetirati i izravno aspirirajte PBS.prijeđite na korak 2. (Ako je teško precipitirati i stanice su ponovno resuspendirane, može se izvesti 1000×g centrifugiranje 10 minuta nakon odbacivanja supernatanta, stanični talog prijeđite na korak 2)

2. Liza stanica: Uklonite pufer CL, njegovu temperaturu uravnotežite na sobnu temperaturu, DNA Eraser i Foregene Protease Plus II, prema sljedećoj tablici 1-2 pripremljeni sustav za lizu: (Otopina za lizu je spremna za upotrebu).

Tablica 1-2: cijepanje priprema sustava (Napomena: u pripremi na ledu)

3. (Ploča s 24 jažice kao primjer) Pipetirajte 200 μl glavne mješavine za lizu stanica u svaku jažicu, Opetovano puhajte 5-10 puta, Inkubirajte na sobnoj temperaturi (20-25 ℃) 5 minuta.

Bilješka:Kako biste izbjegli stvaranje mjehurića, prilikom pipetiranja skala pipete bila je podešena na 200 μl ili manje.Stanice mogu izgledati zamućene nakon lize, što je normalno.

4. (ploča s 24 jažice kao primjer) dodaje se u tekućinu 20 μl pufera ST (različiti sustavi lize pufera ST dodaju se u količini prikazanoj u tablici 1-3), ponovljeno pipetiranje 5-10 puta, na sobnoj temperaturi (20-25 ℃) inkubirano je 2 minute.

Bilješka:Vrh pipete postavljen ispod površine, osiguravajući da je lizat dodan，kako biste izbjegli stvaranje mjehurića, prilikom pipetiranja skala pipete je podešena na 200 μl ili manje.

Tablica 1-3:Dodaj međuspremnik ST

5. Lizat se koristi za sljedeće RT-qPCR eksperimente.Ako se sljedeći eksperimenti ne mogu izvesti na vrijeme, držite ga na ledu najviše 2 sata i čuvajte na -20 ℃ ili -80 ℃ (ne više od tri mjeseca).

B: Priprema RT sustava

1. Izvadite 5 × Direct RT Mix i stavite je u ledenu kupelj, pustite da se prirodno otopi i nježno je promiješajte za kasniju upotrebu;izvadite ddH2O bez RNaze i otopite ga te stavite u ledenu kupelj za kasniju upotrebu.Pripremite reakcijski sustav na ledu prema tablici 2-1 u nastavku.

Tablica 2-1: Priprema RT reakcijskog sustava

2. Nakon završetka formulacije sustava, lagano promiješajte i kratko centrifugirajte u sljedećoj tablici 2 -2 uvjeta reakcije RT reakcija.

Tablica 2-2: Postavka uvjeta RT reakcije

3. Nakon završetka reakcije, produkt reakcije stavljen je izravno na led za qPCR, molimo stavite dugotrajno čuvanje na -20 ℃ ili -80 ℃.

Napomena: Zbog upotrebe nepročišćenog predloška, ​​u proizvodu obrnute transkripcije mogu se pojaviti bijeli talozi.Ovo je normalna pojava.Odmah centrifugirajte supernatant za sljedeće pokuse.

Dobivena RT reakcijska otopina dodaje se u sljedeći korak PCR reakcijskih sustava u stvarnom vremenu, preporučuje se dodavanje količina u rasponu od 10-30% reakcijskog sustava.

C: Priprema qPCR reakcijskog sustava

1. Odgovarajuća količina B pripremljena u koraku cDNA predloška prema sljedećoj tablici 3-1 za pripremu reakcijskog sustava.

Napomena: Količina cDNA predloška čini 10-30% qPCR sustava.Na primjer, u sustavu qPCR od 20 μl dodajte 2-6 μl pufera za lizu, ali ne više od 6 μl.

2. Dobri uvjeti optimizacije qPCR (temperatura žarenja, itd.) za qPCR reakciju (uvjeti reakcije dani u tablici 3-2).

Napomena: pokušajte koristiti optimizirane uvjete za qPCR reakcije kako biste dobili bolje rezultate.

Tablica 3-1: Priprema PCR reakcijskog sustava

1*: Koncentracija primera može se prilagoditi u rasponu od 50-900 nM kada je učinak reakcije primera loš.

Napomena: qPCR sustav može se prilagoditi prema eksperimentalnim potrebama i modelu fluorescentnog ciklusa.Za qPCR u 50μl sustava, prilagodite dozu reagensa proporcionalno prema 20μl sustav.

2*: Odaberite odgovarajuću konačnu koncentraciju ROX referentne boje prema fluorescentnom kvantitativnom termocikleru.Najprikladnije ROX referentne koncentracije boje za uobičajene kvantitativne ciklere fluorescencije prikazane su u tablici u nastavku:

Tablica 3-2: Navedeni su uvjeti qPCR reakcije

Napomena: kako bi se postigao najbolji qPCR učinak, gradijent PCR se može koristiti za optimizaciju reakcijskih uvjeta za različite predloške i različite početnice.Uvjeti PCR reakcije variraju ovisno o analizatoru fluorescencije, šabloni, primeru itd. U specifičnoj operaciji potrebno je osmisliti optimalne reakcijske uvjete u skladu sa specifičnim uvjetima fluorescentnog kvantitativnog termičkog ciklera, tipu šablona, ​​veličini fragmenta od interesa, baznoj sekvenci umnoženog fragmenta i sadržaju GC i duljini primera, uključujući temperaturu žarenja, vrijeme reakcije itd.

Načela dizajna početnica za PCR u stvarnom vremenu

Forward Primer i Reverse Primer

Za PCR u stvarnom vremenu, dizajn primera je vrlo važan.Primeri su povezani sa specifičnošću i učinkovitošću PCR amplifikacije i mogu se dizajnirati prema sljedećim načelima:

◆ Duljina primera: 18-30bp.

◆ GC sadržaj: 40-60%.

◆ Tm vrijednost: Softver za dizajn primera, kao što je Primer 5, može dati Tm vrijednost primera.Vrijednosti Tm uzvodno i nizvodno početnica trebaju biti što bliže.Također se može koristiti formula za izračun Tm: Tm = 4 °C (G + C) + 2 °C (A + T).Prilikom izvođenja PCR-a, temperatura ispod vrijednosti Tm klica od 5 °C općenito se odabire kao temperatura žarenja (odgovarajuće povećanje temperature žarenja može povećati specifičnost PCR reakcije).

◆ Primeri i PCR proizvodi:

◆ Poželjno je da duljina produkta PCR amplifikacije bude 100-150 bp.

◆ Primere za dizajn u sekundarnom strukturnom području predloška treba izbjegavati što je više moguće.

◆ Izbjegavajte stvaranje 2 ili više komplementarnih baza između 3' krajeva uzvodnog i nizvodnog početnica.

◆ Primer 3' terminalna baza ne može biti prisutna s 3 dodatna uzastopna G ili C.

◆ Sami primeri ne mogu imati komplementarne strukture, inače će se formirati ukosnica, što utječe na PCR pojačanje.

◆ ATCG treba raspodijeliti što je ravnomjernije moguće u nizu početnica, a 3' terminalnu bazu treba izbjegavati jer T.

dodatak1:Cell IzravnoRT-qPCR Sastavni dio kompletat dodatak pakiranju

1. Otopina za lizu stanica