Sterilizacija vrhova pipeta i EP cijevi itd.

1. Pripremite 0,1% (jedan tisućiti) DEPC (visoko toksična tvar) s deioniziranom vodom, pažljivo ga koristite u napi i čuvajte na 4°C daleko od svjetlosti;

DEPC voda je čista voda tretirana DEPC-om i sterilizirana visokom temperaturom i visokim tlakom.Testirano da ne sadrži RNazu, DNazu i proteinazu.

2. Stavite vrh pipete i EP cijev u 0,1% DEPC i provjerite jesu li vrh pipete i EP cijev napunjeni s 0,1% DEP.

3. Zaštititi od svjetlosti, ostaviti da odstoji preko noći (12-24h)

4. Kutiju koja sadrži vrh i EP cijev ne treba namakati u DEPC.Nakon grubog uklanjanja DEPC vode iz vrha ili EP cijevi, spakirajte ga i zamotajte.

5. 121 stupanj Celzija, 30min

6. 180 stupnjeva Celzija, sušiti nekoliko sati (najmanje 3 sata)

Napomena: a.Nosite lateks rukavice i maske kada rukujete DEPC-om!b, ili bez DEPC sterilizacije, 130 ℃, 90 min autoklava (mnogi laboratoriji steriliziraju visokom temperaturom dva puta)

Razmatranja ekstrakcije RNK

Dva glavna fenomena neuspjeha izolacije tkivne RNA

degradacija RNA i ostaci nečistoća u tkivima,što se tiče razgradnje, prvo pogledajmo zašto se RNA ekstrahirana iz uzgojenih stanica ne razgrađuje lako.Svi postojeći reagensi za ekstrakciju RNK sadrže komponente koje brzo inhibiraju RNKazu.Dodajte lizat kultiviranim stanicama i jednostavno ga pomiješajte, sve se stanice mogu temeljito pomiješati s lizatom i stanice su potpuno lizirane.Nakon što se stanice liziraju, aktivni sastojci u lizatu odmah inhibiraju unutarstaničnu RNazu, tako da RNK ostaje netaknuta.Drugim riječima, budući da uzgojene stanice lako i potpuno dolaze u kontakt s lizatom, njihova se RNA ne razgrađuje lako;s druge strane, RNA u tkivu se lako razgrađuje jer stanicama u tkivu nije lako brzo doći u kontakt s lizatom.zbog dovoljnog kontakta.Tako,pod pretpostavkom da postoji način da se tkivo pretvori u jednu stanicu uz inhibiciju aktivnosti RNA, problem razgradnje mogao bi se potpuno riješiti.

Mljevenje tekućim dušikom je najučinkovitija takva metoda.Međutim, metoda mljevenja tekućim dušikom je vrlo problematična, posebno kada je broj uzoraka velik.To je dovelo do sljedeće najbolje stvari: homogenizatora.ThehomogenizatorMetoda ne razmatra pitanje kako je aktivnost RNaze inhibirana prije nego što stanice dođu u kontakt s lizatom, već se radije moli da je stopa razaranja tkiva brža od brzine kojom intracelularna RNaza razgrađuje RN.

Učinak električnog homogenizatora je bolji,i učinak staklenog homogenizatora je loš, ali općenito, metoda homogenizatora ne može spriječiti pojavu degradacije.Stoga, ako je ekstrakcija degradirana, treba koristiti originalni električni homogenizator za mljevenje s tekućim dušikom;originalni stakleni homogenizator treba promijeniti u električni homogenizator ili izravno samljeti tekućim dušikom.Problem je gotovo 100% izvediv.riješiti se.

Problem ostataka nečistoća koji utječe na naknadne pokuse ima više različitih uzroka od degradacije, a rješenja su u skladu s time različita.U zaključku,ako postoji razgradnja ili zaostala nečistoća u tkivu, metoda/reagens ekstrakcije za određeni eksperimentalni materijal mora se optimizirati.Ne morate koristiti svoje dragocjene uzorke za optimizaciju: možete kupiti neke male životinje poput ribe/piletine na tržnici, uzeti odgovarajući dio materijala za ekstrakciju RNA, a drugi dio za ekstrakciju proteina – samljeti s ekstraktom usta, želuca i crijeva.

Ciljna RNA iz ekstrahirane RNA koristi se za različite pokuse praćenja, a njezini zahtjevi za kvalitetom su različiti

konstrukcija knjižnice cDNA zahtijeva cjelovitost RNA bez ostataka inhibitora enzimske reakcije;Northern zahtijeva veći integritet RNA i manje zahtjeve za ostatke inhibitora enzimske reakcije;RT-PCR ne zahtijeva preveliki integritet RNA,ali inhibira enzimske reakcije.Zahtjevi za ostatke su strogi.Ulaz određuje izlaz;svaki put kad je cilj dobiti RNA najveće čistoće, to će koštati ljude i novac.

Prikupljanje/pohranjivanje uzoraka

Čimbenici koji utječu na razgradnju Nakon što uzorak napusti živo tijelo/ili izvorno okruženje rasta, endogeni enzimi u uzorku počet će razgrađivati ​​RNA,a brzina razgradnje povezana je sa sadržajem endogenih enzima i temperaturom.Tradicionalno, postoje samo dva načina za potpunu inhibiciju aktivnosti endogenog enzima: odmah dodajte lizat i temeljito i brzo homogenizirajte;izrezati na male komadiće i odmah zamrznuti u tekućem dušiku.Oba pristupa zahtijevaju brz rad.Potonji je prikladan za sve uzorke, dok je prvi prikladan samo za tkiva s niskim sadržajem stanica i endogenih enzima te se lakše homogenizira.Konkretno, biljno tkivo, jetru, timus, gušteraču, slezenu, mozak, masno tkivo, mišićno tkivo itd. najbolje je zamrznuti tekućim dušikom prije nastavka.

Fragmentacija i homogenizacija uzoraka

Čimbenici koji utječu na razgradnju i prinos Fragmentacija uzorka jeza temeljitu homogenizaciju, koji je za potpuno i potpuno oslobađanje RNA.Stanice se mogu izravno homogenizirati bez lomljenja.Tkiva se mogu homogenizirati tek nakon lomljenja.Kvasac i bakterije moraju se razbiti odgovarajućim enzimima prije nego što se mogu homogenizirati.Tkiva s nižim sadržajem endogenih enzima i lakšom homogenizacijom mogu se usitniti i homogenizirati u jednom trenutku u lizatu pomoću homogenizatora;biljno tkivo, jetra, timus, gušterača, slezena, mozak, masno tkivo, mišićno tkivo i drugi uzorci, ili su visoki u endogenim enzimima ili ih nije lako homogenizirati,pa se razbijanje tkiva i homogenizacija moraju provoditi odvojeno.Najpouzdaniji i najproduktivniji način usitnjavanja je mljevenje tekućim dušikom, a najpouzdaniji način homogenizacije je uporaba električnog homogenizatora.Posebna napomena o mljevenju s tekućim dušikom: uzorak se ne smije odmrzavati tijekom cijelog procesa mljevenja, jer postoji veća vjerojatnost da će endogeni enzimi djelovati kada se zamrznu.

Izbor lizata

Utjecaj na pogodnost rada i čimbenici zaostalih endogenih nečistoća Uobičajeno korištene otopine za lizu mogu gotovo inhibirati aktivnost RNaze.Stoga je ključnu točku pri odabiru otopine za lizu razmotriti u kombinaciji s metodom pročišćavanja.Postoji jedna iznimka:uzorcima s visokim sadržajem endogenih enzima preporučuje se uporaba lizata koji sadrži fenol kako bi se povećala sposobnost inaktivacije endogenih enzima.

Izbor metode pročišćavanja

Čimbenici koji utječu na rezidualne endogene nečistoće, brzina ekstrakcije. Za čiste uzorke kao što su stanice, zadovoljavajući rezultati mogu se dobiti s gotovo svakom dostupnom metodom pročišćavanja.Ali za mnoge druge uzorke, posebno one s visokim razinama nečistoća kao što su biljke, jetra, bakterije itd., odabir odgovarajuće metode pročišćavanja je ključan.Metoda centrifugalnog pročišćavanja u koloni ima veliku brzinu ekstrakcije i može učinkovito ukloniti nečistoće koje utječu na kasniju enzimsku reakciju RNA, ali je skupa (Foregene može ponuditi isplative komplete, više detalja klikniteovdje);ekonomičnim i klasičnim metodama pročišćavanja, poput taloženja LiCl-om, također se mogu dobiti zadovoljavajući rezultati, ali je vrijeme rada dugo..

"Tri discipline i osam pozornosti" za ekstrakciju RNK

Disciplina 1:Zaustaviti kontaminaciju egzogenim enzimima.

Napomena 1:Strogo nosite maske i rukavice.

Napomena 2:Centrifugalne epruvete, glave vrhova, šipke za pipete, spremnike za elektroforezu i eksperimentalne stolove koji su uključeni u pokus potrebno je temeljito zbrinuti.

Napomena 3:Reagensi/otopine uključene u eksperiment, posebno voda, moraju biti bez RNaze.

Disciplina 2:Blokirati aktivnost endogenih enzima

Napomena 4:Odaberite odgovarajuću metodu homogenizacije.

Napomena 5:Odaberite odgovarajući lizat.

Napomena 6:Kontrolirajte početnu količinu uzorka.

Disciplina 3:Pojasnite svoju svrhu vađenja

Napomena 7:S bilo kojim sustavom lizata koji se približava maksimalnoj početnoj količini uzorka, stopa uspješnosti ekstrakcije naglo opada.

Napomena 8:Jedini ekonomski kriterij za uspješnu ekstrakciju RNA je uspjeh u sljedećim eksperimentima, a ne prinos.

Top 10 izvora kontaminacije RNazom

1. Prsti su prvi izvor egzogenih enzima, stoga se rukavice moraju često nositi i mijenjati.Osim toga, potrebno je nositi i maske jer je i disanje važan izvor enzima.Dodatna prednost nošenja maske s rukavicama je zaštita eksperimentatora.

2. Vrhovi pipeta, centrifugalne epruvete, pipete – RNaza se ne može deaktivirati samo sterilizacijom, stoga vrhove pipeta i centrifugalne epruvete treba tretirati DEPC-om, čak i ako su označeni kao tretirani DEPC-om.Najbolje je koristiti pipetu za posebne namjene, koju prije upotrebe obrišite vatom od 75% alkohola, posebno šipku;osim toga, nemojte koristiti skidač glave.

3. Voda/pufer mora biti bez kontaminacije RNazom.

4. Barem ispitni stol treba obrisati vatom od 75% alkohola.

5. Endogena RNaza Sva tkiva sadrže endogene enzime, pa je brzo zamrzavanje tkiva tekućim dušikom najbolji način za smanjenje razgradnje.Metoda skladištenja/mljevenja tekućim dušikom doista je nezgodna, ali to je jedini način za tkiva s visokim razinama endogenih enzima.

6. Uzorci RNA Proizvodi za ekstrakciju RNA mogu sadržavati tragove kontaminacije RNazom.

7. Ekstrakcija plazmida Ekstrakcija plazmida često koristi Rnazu za razgradnju RNA, a zaostalu Rnazu treba probaviti s Proteinazom K i ekstrahirati PCI.

8. Skladištenje RNK Čak i ako se skladišti na niskoj temperaturi, tragovi RNaze uzrokovat će degradaciju RNK.Najbolje rješenje za dugotrajno očuvanje RNA je sol/alkoholna suspenzija, jer alkohol inhibira svu enzimsku aktivnost na niskim temperaturama.

9. Kada kationi (Ca, Mg) sadrže ove ione, zagrijavanje na 80C tijekom 5 minuta uzrokovat će cijepanje RNA, tako da ako je potrebno zagrijati RNA, otopina za konzerviranje mora sadržavati kelirajuće sredstvo (1 mM natrijevog citrata, pH 6,4).

10. Enzimi korišteni u narednim eksperimentima mogu biti kontaminirani RNazom.

10 savjeta za ekstrakciju RNK

1: Brzo spriječite aktivnost RNaze.Uzorci se brzo zamrznu nakon prikupljanja, a RNaza se inaktivira brzim radom tijekom lize.

2: Odaberite odgovarajuću metodu ekstrakcije za tkivo s visokim sadržajem ribozima, a za masno tkivo najbolje je koristiti metodu koja sadrži fenol.

3: Kvaliteta predviđanja zahtijeva Northern, konstrukcija cDNA knjižnice zahtijeva visoku cjelovitost, a RT-PCR i RPA (ispitivanje zaštite od ribonukleaze) ne zahtijevaju visoku cjelovitost.RT-PCR zahtijeva visoku čistoću (ostaci inhibitora enzima).

4: Temeljita homogenizacija je ključ za poboljšanje prinosa i smanjenje degradacije.

5: Provjerite integritet detekcije RNK elektroforeze, 28S: 18S = 2:1 je potpuni znak, 1:1 je također prihvatljiv za većinu eksperimenata.

6: Uklanjanje DNA za RT-PCR, analiza niza Najbolje je koristiti Dnase I za uklanjanje DNA.

7: Smanjite kontaminaciju egzogenim enzimima – enzimi se ne mogu uvesti izvana.

8: Kod koncentriranja nukleinske kiseline niske koncentracije treba dodati reagens za koprecipitaciju.Ali da spriječi kontaminaciju koprecipitanta koji sadrži enzime i DNK.

9: Temeljito otopite RNA, ako je potrebno, zagrijavajte na 65 °C 5 minuta.

prikladan način skladištenja

Kratko se može čuvati na –20C, a dugo na –80C.Prvi korak u poboljšanju prinosa RNA je spoznaja da sadržaj RNA u različitim uzorcima uvelike varira.Visoka zastupljenost (2-4ug/mg) kao što su jetra, gušterača, srce, srednja zastupljenost (0,05-2ug/mg) kao što su mozak, embrij, bubreg, pluća, timus, jajnici, niska zastupljenost (<0,05ug/mg) mg) kao što su mjehur, kosti, mast.

1: Lizirati stanice za oslobađanje RN – ako se RNA ne oslobodi, prinos će biti smanjen.Električna homogenizacija radi bolje od drugih metoda homogenizacije, ali je također potrebno kombinirati s drugim metodama, kao što je miješanje tekućim dušikom, enzimska probava (lizozim/litikaza)

2: Optimizacija metode ekstrakcije.Najveći problemi kod metoda na bazi fenola su nepotpuna stratifikacija i djelomični gubitak RNA (supematant se ne može u potpunosti ukloniti).Nepotpuna stratifikacija je posljedica visokog sadržaja nukleinske kiseline i proteina, što se može riješiti povećanjem količine korištenog lizata ili smanjenjem količine uzorka.Korak ekstrakcije kloroformom dodan je u masno tkivo.Gubitak RNA može se smanjiti povratnim pumpanjem ili uklanjanjem organskog sloja nakon čega slijedi centrifugiranje.Najveći problem s metodama koje se temelje na kolonskom centrifugiranju je višak uzorka.

Klasični savjeti za vađenje

1. Pročišćavanje fenolom: Dodajte jednaki volumen fenol/kloroforma u omjeru 1:1 i snažno miješajte 1-2 minute.Centrifugirajte velikom brzinom 2 minute.Pažljivo uklonite supernatant (80-90%).Nikada nemojte doći do srednjeg sloja.Jednaki volumen reakcijske otopine može se dodati u fenol/kloroform i odstraniti supernatant.Dva supernatanta se mogu pomiješati zajedno za taloženje nukleinske kiseline kako bi se poboljšao prinos.Nemojte biti previše nježni prilikom miješanja i ne pokušavajte ukloniti sav supernatant.

2. Ispiranje sa 70-80% etanolom: Tijekom ispiranja, nukleinska kiselina mora biti suspendirana kako bi se osiguralo da se zaostala sol ispere.Istodobno, odmah nakon izlijevanja etanola, centrifugirajte na velikoj brzini nekoliko sekundi, a zatim uklonite zaostali etanol pipetom.Otopiti nakon stajanja na sobnoj temperaturi 5-10 minuta.

11. Ekstrakcija posebnih organizacija

1. Vlaknasto tkivo: Ključ za ekstrakciju RNA iz fibroznog tkiva kao što je srčani/skeletni mišić je potpuno poremetiti tkivo.Ova tkiva imaju nisku gustoću stanica, pa je količina RNA po jedinici težine tkiva niska, te je najbolje koristiti što veću početnu količinu.Obavezno temeljito samljeti tkivo u uvjetima smrzavanja.

2. Tkiva s visokim udjelom proteina/masti: udio moždane/biljne masti je visok.Nakon PCI ekstrakcije, supernatant sadrži bijele flokule.Supernatant se mora ponovno ekstrahirati kloroformom.

3. Tkiva s visokim sadržajem nukleinske kiseline/ribozima: slezena/timus ima visok sadržaj nukleinske kiseline i ribozima.Mljevenje tkiva u uvjetima smrzavanja nakon čega slijedi brza homogenizacija može učinkovito inaktivirati ribozime.Međutim, ako je lizat previše viskozan (zbog visokog sadržaja nukleinske kiseline), PCI ekstrakcija neće moći učinkovito stratificirati;dodavanje više lizata može riješiti ovaj problem.Višestruke PCI ekstrakcije mogu ukloniti više rezidualne DNK.Ako se odmah nakon dodavanja alkohola stvori bijeli talog, to ukazuje na kontaminaciju DNK.Ponovna ekstrakcija s kiselom PCI nakon otapanja može ukloniti kontaminaciju DNK.

4. Biljno tkivo: Biljno tkivo je složenije od životinjskog.Općenito, biljke se melju pod uvjetima tekućeg dušika, tako da je razgradnja RNA pomoću endogenih enzima neuobičajena.Ako se problem razgradnje ne riješi, gotovo je sigurno uzrokovan nečistoćama sadržanim u uzorku.Nečistoće sadržane u mnogim biljkama dovest će do rezidua, a razlog za rezidue je često taj što te nečistoće imaju neke sličnosti s RNK: ti precipitiraš i ja taložim, a ti adsorbiraš i ja adsorbiram.Ove karakteristike određuju da su oni vrlo jaki inhibitori enzima.

Trenutačno se komercijalni reagensi za ekstrakciju RNA mogu prilagoditi gotovo svim životinjskim tkivima uz male prilagodbe, ali postoji nekoliko komercijalnih reagensa za ekstrakciju RNA koji mogu biti prikladni za većinu biljnih tkiva.Srećom, Foregene može pružiti posebnepribor za ekstrakciju biljne RNK, imamoSet za izolaciju ukupne biljne RNK, Plant Total RNA Isolation Kit Plus.Potonji je posebno dizajniran za biljke s visokim sadržajem polisaharida i polifenola.Za ekstrakciju RNA, povratne informacije korisnika laboratorija su posebno dobre.

12. Učinak smrzavanja i odmrzavanja uzorka Zamrznuti uzorak može biti veći i potrebno ga je izrezati prije upotrebe za ekstrakciju RNA.Uzorci imaju tendenciju rastopiti se (moguće djelomično) tijekom rezanja.Zamrznute uzorke možda će trebati izvagati prije ekstrakcije RNK, a odmrzavanje će sigurno doći tijekom ovog procesa.Ponekad do otapanja uzorka dolazi i tijekom postupka mljevenja tekućim dušikom;ili se smrznuti uzorak izravno dodaje u lizat bez mljevenja tekućim dušikom, a odmrzavanje će se sigurno dogoditi prije potpune homogenizacije.Eksperimenti su pokazali da je smrznuto tkivo sklonije razgradnji RNK tijekom odmrzavanja nego svježe tkivo.Vjerojatni razlog: Proces smrzavanja-otapanja remeti strukture unutar stanice, olakšavajući endogenim enzimima izravan kontakt s RNK.

13. Procjena kvalitete RNA Obično se elektroforeza koristi za procjenu integriteta RNA, a A260/A280 koristi se za procjenu čistoće RNA.U teoriji, intaktna RNA ima omjer 28S:18S = 2,7:1, a većina podataka naglašava omjer 28S:18S = 2:1.Činjenica je da gotovo niti jedna RNA ekstrahirana iz uzoraka osim stanica nije u omjeru 2:1 (ovo je dobiveno pomoću Agilent Bioanalyzera).

Na rezultate elektroforeze RNA utječu mnogi čimbenici, uključujući sekundarnu strukturu, uvjete elektroforeze, opterećenje uzorkom, stupanj zasićenja EB-om itd. Koristite nativnu elektroforezu za otkrivanje RNA i koristite DNA marker kao kontrolu.Ako su 28S na 2 kb i 18S na 0,9 kb čisti, a 28S: 18S > 1, cjelovitost može zadovoljiti zahtjeve većine sljedećih eksperimenata.

A260/A280 je indikator koji je izazvao mnogo zabune.Prije svega, potrebno je razjasniti izvorno značenje ovog pokazatelja za nukleinske kiseline: čista RNK, njen A260/280 = oko 2,0.Čista RNA je 'uzrok', a A260/A280 = 2 je 'posljedica'.Sada svi koriste A260/A280 kao 'uzrok', misleći da "ako je A260/A280 = 2, onda je RNK čista", što prirodno dovodi do zabune.

Ako ste zainteresirani, možete dodati malo reagensa koji se često koristi u ekstrakciji, kao što je fenol, gvanidin izotiocijanat, PEG itd., u vaš RNA uzorak, a zatim izmjeriti omjer A260/A280.Stvarnost je da mnogi reagensi koji se koriste za ekstrakciju RNK, kao i mnoge nečistoće u uzorku, apsorbiraju oko A260 i A280, utječući na A260/A280.

Trenutačno najpoučniji pristup je skeniranje uzoraka RNA u rasponu od 200-300 nm.Krivulja čiste RNK ima sljedeće karakteristike: krivulja je glatka, A230 i A260 dvije su točke infleksije, A300 je blizu 0, A260/A280 = oko 2,0 i A260/A230 = oko 2,0.Ako podaci skeniranja nisu dostupni, također se mora odrediti omjer A260/A230, budući da je taj omjer osjetljiviji na prijenos svih nečistoća koje utječu na enzimsku reakciju.Uzmite u obzir linearni raspon uređaja (0,1–0,5 za A260).

Postoje još dva korisna fenomena: omjer će biti oko 0,3 niži kada se A260/A280 mjeri u vodi;dok je omjer izmjeren u 10 mM EDTA oko 0,2 veći od onog izmjerenog u 1 mM EDTA.

Povezani proizvodi:

Proizvođač i dobavljač kompleta za izolaciju ukupne RNA biljke u Kini |Foregene (foreivd.com)

Serija izolacije RNK Dobavljači i tvornica |Proizvođači serije izolacije RNA u Kini (foreivd.com)

Serija izolacije RNK – Foregene Co., Ltd. (foreivd.com)