RT-qPCR eksperiment uključuje ekstrakciju RNK i procjenu kvalitete, obrnutu transkripciju i qPCR tri koraka, svaki korak ima mnogo mjera opreza, koje ćemo detaljno predstaviti u nastavku.

Ⅰ.Procjena kvalitete RNA

U RT-qPCR eksperimentu, nakon završetka ekstrakcije RNK, potrebno je procijeniti kvalitetu RNK, a naknadni eksperiment se može provesti tek nakon što se kvalificira.Metode evaluacije uključuju spektrofotometar, Agilent gel elektroforezu, Agilent 2100 analizu, među kojima se najčešće koriste spektrofotometar i metoda detekcije elektroforezom u agaroznom gelu.Treba napomenuti da se ove dvije metode moraju koristiti zajedno kako bi se dovršila detekcija i analiza koncentracije, čistoće i cjelovitosti RNK, kako bi se osigurala kvaliteta RNK.

Povezani komplet za izolaciju RNK: 

Cell Total RNA Isolation Kit

Visoko pročišćena i visokokvalitetna ukupna RNA može se dobiti iz različitih uzgojenih stanica u 11 minuta.

Komplet za izolaciju ukupne životinjske RNK

Brzo i učinkovito ekstrahirajte ukupnu RNK visoke čistoće i kvalitete iz različitih životinjskih tkiva.

Spektrofotometar:

Spektrofotometar se uglavnom koristi za određivanje koncentracije i čistoće RNA, ali ne može otkriti cjelovitost RNA i genomskog ostatka.Među njima, A260/280 i A260/230 važni su parametri za detekciju čistoće RNA, a čistoća RNA može se otkriti prema fluktuaciji njihovih vrijednosti:

1. 1,9< A260/280< 2,1, što ukazuje da je čistoća RNA dobra;A260/280<1,9, što ukazuje da možda postoji proteinski ostatak u RNA;A260/280>2.1, što ukazuje na moguću djelomičnu degradaciju RNA, što se dalje može potvrditi elektroforezom u agaroznom gelu.

2. 2.0< A260/230< 2.2, što ukazuje da je čistoća RNA dobra;A260/230< 2,0, što ukazuje da u RNA mogu postojati ostaci organskih reagensa, poput fenola, etanola ili šećera.

Elektroforeza u agaroznom gelu:

Analiza elektroforeze u agaroznom gelu može analizirati integritet RNA, genom i proteinske ostatke, ali ne može točno kvantificirati koncentraciju RNA ili detektirati ostatke organskih reagensa.Uzmimo za primjer predloške eukariotske RNA:

1. RNA je podvrgnuta elektroforezi u agaroznom gelu.Ako su na mapi gela postojale samo tri pojedinačne trake 28sRNA, 18sRNA i 5.8sRNA, to znači da je ekstrahirana RNA netaknuta.Ako postoji fenomen povlačenja, to ukazuje na djelomičnu degradaciju RNK.

2. Ako postoji jedna svijetla traka između rupice za ljepilo i trake 28sRNA, možda postoji ostatak genomske DNK.

3. Ako se trake pojave u otvoru za ljepilo, to znači da možda postoje ostaci proteina i drugih makromolekularnih tvari.

Ⅱ. Obrnuta transkripcija

Nakon što je ekstrakcija RNK dovršena, potrebno ju je preokrenuti u cDNA za sljedeće eksperimente, tako da je korak preokreta bitan.Reverzna transkripcija bit će predstavljena odabirom reverzne transkriptaze i početnice:

Izbor reverzne transkriptaze:

Tipične reverzne transkriptaze uključuju AMV RTase i MMLV RTase.RNaza H AMV RTase ima jaku aktivnost, kratko trajanje sinteze, nisku količinu sinteze i dobru toplinsku stabilnost (42 ~ 55 ℃).Aktivnost RNaze H MMLV RTaze je slaba, duljina sinteze je duga, količina sinteze je visoka, a toplinska stabilnost je loša (37 ~ 42 ℃).

Budući da enzim RNaza H ima funkciju degradacije šablona RNA, MMLV sa slabom aktivnošću RNaze H trebao bi biti preferirano odabran tijekom reverzne transkripcije, a nakon kasnijeg genetskog inženjeringa, toplinska stabilnost MMLV je dosegla kvalitativni skok.Uzimanje ForegeneForeasy reverzna transkriptaza (M-MLV za reverznu transkripciju) kao primjer, to je nova reverzna transkriptaza izražena u E. coli konstruiranoj bakteriji korištenjem tehnologije genetske rekombinacije.To je rekombinantna DNA polimeraza koja sintetizira komplementarni lanac DNA iz jednolančane RNA, DNA ili hibrida RNA:DNA.Nema aktivnost RNaze H, jaku stabilnost, jak afinitet prema RNK i visoku osjetljivost detekcije.

 

Foreasy reverzna transkriptaza (M-MLV za reverznu transkripciju)

Izbor temeljnog premaza:

Općenito, RT početnice spadaju u tri kategorije: oligo dT, nasumične početnice i genski specifične početnice.Odaberite odgovarajuće temeljne premaze za upotrebu u skladu s različitim eksperimentalnim zahtjevima.

1. Ako je predložak eukariotskog podrijetla i kasna cDNA se koristi za rutinsko PCR pojačanje, preporučuje se Oligo (dT);Ako se sljedeći eksperiment koristi samo za qPCR, preporučuje se miješanje Oligo (dT) s nasumičnim početnicama kako bi se poboljšala učinkovitost reverzne transkripcije.

2. Ako je predložak iz prokariota, za reverznu transkripciju treba odabrati nasumične početnice ili genske specifične početnice.

Ⅲ.qPCR

Kvantifikacija fluorescencije uglavnom se razrađuje odabirom kvantitativnih metoda, načela dizajna primera, odabira ROX-a, konfiguracije reakcijskog sustava i postavljanja uvjeta reakcije itd.

Odabir kvantitativnih metoda:

Kvantitativne metode se dijele na relativne kvantitativne metode i apsolutne kvantitativne metode.Relativna kvantifikacija može se koristiti za otkrivanje učinka određenih metoda liječenja na ekspresiju gena, otkrivanje razlike ekspresije gena u različitim vremenima i usporedbu razlike ekspresije gena u različitim tkivima.Apsolutna kvantifikacija može otkriti količinu nukleinske kiseline u virusu i tako dalje.Kada radimo pokuse, moramo odabrati odgovarajuće kvantitativne metode u skladu s vlastitim pokusima.

Principi dizajna temeljnog premaza:

Dizajn primera za qPCR izravno je povezan s učinkovitošću pojačanja i specifičnošću proizvoda.Stoga je pravilno dizajniranje dobrih početnica prvi korak uspješnog qPCR-a.U dizajnu temeljnog premaza treba obratiti pozornost na sljedeća načela pri ispunjavanju načela konvencionalnog dizajna temeljnog premaza:

1. Duljina ciljanog fragmenta kontrolira se između 100 i 300 bp;

2. Unakrsni dizajn egzona kako bi se izbjegao utjecaj genomske DNA;

3. Dizajnirane početnice potrebno je testirati na učinkovitost pojačanja, a tek kada učinkovitost pojačanja dosegne standard (90-110%), mogu se koristiti za kvantitativne pokuse;

4. Koncentracija primera obično se optimizira između 0,1 uM i 1,0 uM.

Odabir odROX:

U procesu kvantitativne reakcije ROX može ravnomjerno prilagoditi razliku optičkog puta, pogrešku pipetiranja ili razliku u volumenu uzrokovanu isparavanjem i kondenzacijom, poboljšavajući ponovljivost rezultata.Međutim, treba napomenuti da je odabir ROX-a vezan uz instrument.Ako qPCR instrument ima funkciju automatskog ispravljanja razlike između rupa, ne treba dodati ROX;u suprotnom treba dodati ROX korekciju.Mali partneri u kupnji reagensa moraju biti u skladu s instrumentom koji se koristi kako bi odabrali ispravan ROX, kako bi izbjegli kasnije pogreške.

Priprema reakcijskog sustava:

Poželjni su reakcijski volumeni od 20 ul i 50 ul.Prilikom formuliranja sustava treba obratiti pozornost na sljedeće stvari:

1. Reakcijski sustav potrebno je pripremiti ventilacijom u ultra čistom radnom stolu, novi ddH₂O se koristi za svaki eksperiment;

2. Svaki eksperiment treba pripremiti NTC kako bi se provjerilo postoji li onečišćenje u sustavu, a svaki par primera treba napraviti NTC prilikom pripreme sustava;

3. Da bi se otkrilo postoji li gDNA ostatak u RNA šabloni, NRT se može pripremiti za svaki uzorak za detekciju;

4. Prilikom pripreme sustava preporuča se napraviti najmanje 3 tehnička ponavljanja za jedan uzorak;

5. Kada je predložak cDNA, preporučuje se razrijediti 5-10 puta kako bi se smanjio učinak inhibicije sustava obrnute transkripcije na qPCR eksperiment.Bolje je istražiti količinu predloška prema gradijentu, tako da CT vrijednost pada između 20-30;

6. Odrediti potreban broj reakcija, povećati za 5-10% na temelju broja reakcija i izračunati broj konfiguracije volumena;

7, sustav se priprema prema principu premiksa, miješanjem nakon centrifugiranja i osiguravanjem da nema mjehurića;

8, Što je više moguće odabrati prateći potrošni materijal.

Povezani komplet za RT-qPCR