Osnovna osnova dizajna (99% problema se može riješiti)
1. Duljina početnog teksta: Udžbenik zahtijeva 15-30 bp, obično oko 20 bp.Stvarno stanje je bolje da bude 18-24 bp kako bi se osigurala specifičnost, ali što je dulje to bolje, predugi primer također će smanjiti specifičnost i smanjiti prinos.
2. Raspon amplifikacije primera: 200-500 bp je prikladno, a fragment se može proširiti na 10 kb pod određenim uvjetima.
3. Temeljna baza: Sadržaj G+C trebao bi biti 40-60%, premali G+C učinak pojačanja nije dobar, previše G+C može lako pojaviti nespecifične trake.ATGC je najbolje raspodijeliti nasumično, izbjegavajući klastere od više od 5 purinskih ili pirimidinskih nukleotida.Multi-gc za 5' kraj i srednje sekvence za povećanje stabilnosti, izbjegavajte bogati GC na 3' kraju, bez GC za posljednje 3 baze ili bez GC za 3 od zadnjih 5 baza.
4. Izbjegavajte sekundarnu strukturu u početnicama i izbjegavajte komplementaciju između dvaju početnica, osobito komplementaciju na 3' kraju, inače će se formirati dimer početnice i generirati nespecifične amplificirane trake.
5. Baze na 3' kraju početnica, posebno zadnja i pretposljednja baza, trebaju biti striktno uparene kako bi se izbjegao neuspjeh PCR-a zbog nesparenih terminalnih baza.
6. Primeri imaju ili se mogu dodati s odgovarajućim mjestima cijepanja, a amplificirana ciljna sekvenca trebala bi poželjno imati odgovarajuća mjesta cijepanja, što je vrlo korisno za analizu cijepanja ili molekularno kloniranje.
7. Specifičnost početnica: početnice ne smiju imati očitu homologiju s drugim sekvencama u bazi podataka sekvenci nukleinskih kiselina.
8. Naučite koristiti softver: PP5, Oligo6, DNAstar, Vector NTI, primer3 (Ovaj mrežni dizajn najbolje funkcionira).
Gornji sadržaj može riješiti najmanje 99% problema dizajna primera.
Kontrolirajte detalje dizajna primera
1. Duljina temeljnog premaza
Opća duljina primera je 18~30 baza.Općenito, najvažniji faktor koji određuje temperaturu žarenja temeljnog premaza je duljina temeljnog premaza.Općenito je odabrana temperatura žarenja temeljnog premaza (vrijednost Tm -5 ℃), a neki izravno koriste vrijednost Tm.Sljedeće formule mogu se koristiti za grubo izračunavanje temperature žarenja primera.
Kada je duljina početnice manja od 20 bp: [4(G+C)+2(A+T)]-5℃
Kada je duljina primera veća od 20 bp: 62,3 ℃+0,41 ℃ (%GC)-500/duljina-5 ℃
Osim toga, mnogi se softveri također mogu koristiti za izračunavanje temperature žarenja, princip izračuna će biti drugačiji, tako da ponekad izračunata vrijednost može imati mali razmak.Za optimizaciju PCR reakcija koriste se najkraći primeri koji osiguravaju temperature žarenja ne manje od 54 ℃ za najbolju učinkovitost i specifičnost.
Sveukupno, specifičnost početnice povećava se za faktor četiri za svaki dodatni nukleotid, tako da je minimalna duljina početnice za većinu primjena 18 nukleotida.Gornja granica duljine primera nije jako važna, uglavnom se odnosi na učinkovitost reakcije.Zbog entropije, što je početnica duža, to je niža stopa kojom se žari kako bi se vezao na ciljnu DNK kako bi formirao stabilnu dvolančanu matricu za vezanje DNK polimeraze.
Kada se koristi softver za dizajniranje primera, duljina primera može se odrediti prema vrijednosti TM zauzvrat, posebno za primere fluorescentne kvantitativne PCR, TM=60 ℃ ili tako treba kontrolirati.
2.GC sadržaj
Općenito, sadržaj G+C u sekvencama početnica je 40%~60%, a sadržaj GC i vrijednost Tm para početnica trebaju biti usklađeni.Ako primer ima ozbiljnu tendenciju GC ili AT, odgovarajuća količina A, T ili G i C repa može se dodati na 5' kraj primera.
3. Temperatura žarenja
Temperatura žarenja trebala bi biti 5 ℃ niža od temperature bez lanca.Ako je broj baza primera mali, temperatura žarenja se može odgovarajuće povećati, što može povećati specifičnost PCR-a.Ako je broj baza velik, temperatura žarenja se može odgovarajuće smanjiti.Razlika u temperaturi žarenja između para primera od 4 ℃ ~ 6 ℃ neće utjecati na prinos PCR-a, ali idealno je da je temperatura žarenja para primera ista, što može varirati između 55 ℃ ~ 75 ℃.
4. Izbjegavajte područje sekundarne strukture predloška za pojačavanje
Najbolje je izbjegavati područje sekundarne strukture predloška pri odabiru pojačanog fragmenta.Stabilna sekundarna struktura ciljanog fragmenta može se predvidjeti i procijeniti odgovarajućim računalnim softverom, što je od pomoći pri odabiru predloška.Eksperimentalni rezultati pokazuju da je širenje često neuspješno kada je slobodna energija (△G) područja koje treba proširiti manja od 58,6 lkJ/mol.
5. Neusklađenost s ciljnom DNA
Kada je amplificirana ciljna DNK sekvenca velika, početnica se može vezati na više dijelova ciljne DNK, što rezultira pojavom višestrukih traka u rezultatu.Ovaj put potrebno je koristiti testiranje softvera BLAST, web stranica:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/.Odaberite Poravnaj dvije sekvence (bl2seq).
Lijepljenje početnih sekvenci u zonu 1 i ciljnih DNK sekvenci u zonu 2 je međusobno zamjenjivo, a BLAST izračunava komplementarne, antisense i druge mogućnosti, tako da korisnici ne moraju primijetiti jesu li oba lanca sensivna lanca.Također možete unijeti GI broj ako znate GI broj niza u bazi podataka, tako da ne morate lijepiti veliki dio niza.Na kraju kliknite Poravnaj na 3 da vidite ima li početnica više homolognih mjesta u ciljnoj DNK.
6. Primer terminal
3' kraj primera je mjesto gdje počinje produžetak, stoga je važno spriječiti da nepodudaranja tamo počnu.3' kraj ne bi trebao biti više od 3 uzastopna G ili C, jer će to uzrokovati grešku pokretanja početnice u G+C obogaćenoj sekvencijskoj regiji.3'-kraj ne može formirati nikakvu sekundarnu strukturu, osim u posebnim PCR (AS-PCR) reakcijama, 3'-kraj početnice ne može se pogrešno uskladiti.Na primjer, ako je kodirajuća regija pojačana, 3' kraj početnice ne bi trebao biti prekinut na trećoj poziciji kodona, jer je treća pozicija kodona sklona degeneraciji, što će utjecati na specifičnost i učinkovitost amplifikacije.Kada koristite aneksijske početnice, pogledajte tablicu upotrebe kodona, obratite pozornost na biološku preferenciju, nemojte koristiti aneksijske početnice na 3′ kraju i koristite veću koncentraciju početnica (1uM-3uM).
7. Sekundarna struktura početnica
Sami primeri ne bi trebali imati komplementarne sekvence, inače će se sami primeri saviti u ukosnu strukturu, a ova sekundarna struktura će utjecati na vezanje primera i šablona zbog steričke smetnje.Ako se koristi umjetna procjena, kontinuirane komplementarne baze samih početnica ne bi trebale biti veće od 3bp.Ne bi trebalo postojati komplementarnost između dva početnica, posebno treba izbjegavati komplementarno preklapanje 3' kraja kako bi se spriječilo stvaranje dimera početnica.Općenito, ne bi trebalo postojati više od 4 uzastopne baze homologije ili komplementarnosti između para početnica.
8. Dodajte markere ili lokuse
5' kraj ima mali učinak na specifičnost pojačanja i stoga se može modificirati bez utjecaja na specifičnost pojačanja.Modifikacija kraja početnice 5' uključivala je: dodavanje restrikcijskog mjesta enzima;Označeni biotin, fluorescencija, digoksin, Eu3+, itd. Predstavite DNA sekvence vezane za proteine;Uvođenje mutacijskih mjesta, umetanje i nedostajanje mutacijskih sekvenci i uvođenje promotorskih sekvenci, itd. Dodatne baze će više ili manje utjecati na učinkovitost amplifikacije i povećati mogućnost stvaranja dimera početnica, ali za sljedeći korak moraju se napraviti neki ustupci.Dodatne sekvence koje ne postoje na ciljnoj sekvenci, kao što su restrikcijska mjesta i promotorske sekvence, mogu se dodati na 5' kraj početnice bez utjecaja na specifičnost.Ove sekvence nisu uključene u izračun vrijednosti Tm početnice, ali ih treba testirati na komplementarnost i unutarnju sekundarnu strukturu.
9. Subklonovi
Većinu vremena, PCR je samo preliminarno kloniranje, a zatim moramo subklonirati ciljni fragment u različite vektore, tako da moramo dizajnirati dodatne baze za sljedeću operaciju u PCR koraku.
Neke sekvence dizajnirane za subkloniranje su sažete u nastavku.
Dodano je restrikcijsko mjesto restrikcijske endonukleaze
Dodavanje enzimskih restrikcijskih mjesta najčešće je korištena metoda za subkloniranje PCR proizvoda.Općenito, mjesto cijepanja je šest baza, uz 5 'kraj mjesta cijepanja potrebno je dodati 2 ~ 3 zaštitne baze.Međutim, broj zaštitnih baza koje zahtijevaju različiti enzimi je različit.Na primjer, SalⅠ ne zahtijeva zaštitnu bazu, EcoRⅤ zahtijeva 1 zaštitnu bazu, NotⅠ zahtijeva 2 zaštitne baze, a Hind Ⅲ zahtijeva 3 zaštitne baze.
LIC dodaje rep
Puni naziv LIC-a je Ligation-Independent cloning, metoda kloniranja koju je izumio Navogen posebno za svoj dio pET vektora.Nosač pET pripremljen LIC metodom ima nekomplementarne jednolančane ljepljive krajeve od 12-15 baza, koji nadopunjuju odgovarajuće ljepljive krajeve na ciljanom fragmentu umetka.Za potrebe amplifikacije, sekvenca početnice 5' umetnutog fragmenta trebala bi nadopunjavati LIC vektor.Ekstranektna aktivnost 3′→5′ T4 DNA polimeraze može nakon kratkog vremena formirati jednolančani ljepljivi kraj na umetnutom fragmentu.Budući da se proizvod može formirati samo međusobnim žarenjem pripremljenog fragmenta umetka i vektora, ova metoda je vrlo brza i učinkovita, a radi se o usmjerenom kloniranju.
Usmjereni TA klon dodati rep
TA kloniranje nije moglo usmjeriti fragment u vektor, pa je Invitrogen kasnije predstavio vektor koji je mogao ciljati kloniranje, a koji je sadržavao četiri istaknute baze GTGGS na jednom kraju.Stoga, u dizajnu PCR početnica, komplementarne sekvence treba dodati u skladu s tim, tako da se fragmenti mogu "orijentirati".
Ako nemate vremena, možete isprobati izravnu sintezu, kombinirajući gen s vektorom, što je ono što mi u muzekularcima zovemo sinteza ET gena.
D. In-Fusion metoda kloniranja
Nije potrebna ligaza, nije potrebna duga reakcija.Sve dok je slijed na oba kraja lineariziranog vektora uveden u dizajn početnica, tada se PCR produkt i linearizirani vektor dodaju u infuzijsku otopinu enzima koja sadrži BSA i stave na sobnu temperaturu pola sata, transformacija se može izvesti.Ova metoda je posebno prikladna za pretvorbu velikog volumena.
10. Primer spajanja
Ponekad su samo ograničene informacije o sekvenci poznate o dizajnu primera.Na primjer, ako je poznata samo sekvenca aminokiselina, može se dizajnirati spajajući primer.Primer spajanja je mješavina različitih sekvenci koje predstavljaju sve različite mogućnosti baza koje kodiraju jednu aminokiselinu.Kako biste povećali specifičnost, možete pogledati tablicu upotrebe kodona kako biste smanjili aneksiju prema osnovnim preferencijama upotrebe različitih organizama.Hipoksantin se može upariti sa svim bazama kako bi se smanjila temperatura žarenja primera.Nemojte koristiti priložene baze na 3' kraju primera jer je žarenje zadnje 3 baze na 3' kraju dovoljno za pokretanje PCR-a na pogrešnom mjestu.Koriste se veće koncentracije primera (1 μM do 3 μM) jer primeri u mnogim smjesama za pripajanje nisu specifični za ciljni predložak.
PCR sirovinekontrolirati
1. Količina temeljnog premaza
Koncentracija svakog primera je 0,1 ~ 1 umol ili 10 ~ 100 pmol.Bolje je postići željeni rezultat s najmanjom količinom primera.Visoka koncentracija primera uzrokovat će nepodudaranje i nespecifično pojačanje te povećati mogućnost stvaranja dimera između početnica.
2. Koncentracija temeljnog premaza
Koncentracija početnica utječe na specifičnost.Optimalna koncentracija primera općenito je između 0,1 i 0,5 μM.Veće koncentracije početnica dovode do pojačanja nespecifičnih proizvoda.
3. Temperatura žarenja temeljnog premaza
Drugi važan parametar za temeljne premaze je temperatura taljenja (Tm).To je temperatura kada je 50% početnica i komplementarnih sekvenci predstavljeno kao dvolančane molekule DNA.Tm je potreban za postavljanje temperature žarenja za PCR.Idealno, temperatura žarenja je dovoljno niska da osigura učinkovito žarenje početnica s ciljnom sekvencom, ali dovoljno visoka da smanji nespecifično vezanje.Razumna temperatura žarenja od 55 ℃ do 70 ℃.Temperatura žarenja općenito je postavljena 5 ℃ niža od Tm temeljnog premaza.
Postoji nekoliko formula za određivanje Tm, koje se uvelike razlikuju ovisno o korištenoj formuli i slijedu početnica.Budući da većina formula daje procijenjenu vrijednost Tm, sve temperature žarenja samo su početna točka.Specifičnost se može poboljšati analizom nekoliko reakcija koje postupno podižu temperaturu žarenja.Počnite ispod procijenjene Tm-5 ℃ i postupno povećavajte temperaturu žarenja u koracima od 2 ℃.Viša temperatura žarenja smanjit će nastajanje početnih dimera i nespecifičnih proizvoda.Za najbolje rezultate, dva primera trebaju imati približne vrijednosti Tm.Ako je Tm razlika parova primera veća od 5 ℃, primeri će pokazati značajan pogrešan početak korištenjem niže temperature žarenja u ciklusu.Ako su dva primera Tm različita, postavite temperaturu žarenja na 5 ℃ nižu od najniže Tm.Alternativno, kako bi se povećala specifičnost, pet ciklusa može se izvesti prvo na temperaturama žarenja predviđenim za višu Tm, nakon čega slijede preostali ciklusi na temperaturama žarenja predviđenim za nižu Tm.To omogućuje dobivanje djelomične kopije odredišnog predloška pod ograničenim uvjetima.
4. Čistoća i stabilnost temeljnog premaza
Standardna čistoća prilagođenih primera primjerena je za većinu PCR primjena.Uklanjanje benzoilnih i izobutililnih skupina odsoljavanjem je minimalno i stoga ne ometa PCR.Neke primjene zahtijevaju pročišćavanje kako bi se uklonile sve sekvence koje nisu pune duljine u procesu sinteze.Ove skraćene sekvence nastaju jer učinkovitost kemije sinteze DNA nije 100%.Ovo je kružni proces koji koristi ponovljene kemijske reakcije dok se svaka baza dodaje kako bi se napravila DNK od 3′ do 5′.Možete doživjeti neuspjeh u oba ciklusa.Dulji primeri, posebno oni veći od 50 baza, imaju veliki udio skraćenih sekvenci i mogu zahtijevati pročišćavanje.
Na prinos primera utječe učinkovitost sintetske kemije i metode pročišćavanja.Biofarmaceutske tvrtke, kao što su Cytology i Shengong, sve koriste minimalnu OD jedinicu kako bi osigurale ukupnu proizvodnju oligonukleozida.Prilagođeni primeri isporučuju se u obliku suhog praha.Najbolje je ponovno otopiti početnice u TE tako da konačna koncentracija bude 100 μM.TE je bolji od deionizirane vode jer je pH vode često kiseo i uzrokovat će hidrolizu oligonukleozida.
Stabilnost temeljnih premaza ovisi o uvjetima skladištenja.Suhi prah i otopljeni primeri trebaju se čuvati na -20 ℃.Primeri otopljeni u TE u koncentracijama većim od 10 μM mogu se stabilno pohraniti na -20 ℃ 6 mjeseci, ali se mogu pohraniti samo na sobnoj temperaturi (15 ℃ do 30 ℃) manje od 1 tjedna.Suhi praškasti primeri mogu se čuvati na -20 C najmanje 1 godinu i na sobnoj temperaturi (15 C do 30 C) do 2 mjeseca.
5. Enzimi i njihove koncentracije
Trenutačno se koristi Taq DNA polimeraza u osnovi enzim genskog inženjeringa koji sintetiziraju koliformne bakterije.Količina enzima potrebna za kataliziranje tipične PCR reakcije je oko 2,5 U (odnosi se na ukupni reakcijski volumen od 100 ul).Ako je koncentracija previsoka, može dovesti do nespecifičnog pojačanja;ako je koncentracija preniska, količina sintetičkog proizvoda će se smanjiti.
6. Kvaliteta i koncentracija dNTP
Kvaliteta dNTP-a usko je povezana s koncentracijom i učinkovitošću PCR amplifikacije.DNTP prah je granuliran, a njegova varijabilnost gubi biološku aktivnost ako se nepravilno skladišti.Otopina dNTP je kisela i treba je koristiti u visokoj koncentraciji, s 1M NaOH ili 1M otopinom Tris.HCL pufera za podešavanje PH na 7,0 ~ 7,5, mala količina podpakiranja, skladištenje u zamrzivaču na -20 ℃.Višestruko zamrzavanje-odmrzavanje degradira dNTP.U PCR reakciji, dNTP bi trebao biti 50 ~ 200 umol/L.Posebice treba obratiti pažnju na to da koncentracija četiri DNTPS bude jednaka (jednak molski preparat).Ako je koncentracija bilo kojeg od njih različita od ostalih (viša ili niža), doći će do neusklađenosti.Preniska koncentracija će smanjiti prinos PCR proizvoda.dNTP se može spojiti s Mg2+ i smanjiti koncentraciju slobodnog Mg2+.
7. Matrica (ciljni gen) nukleinska kiselina
Količina i stupanj pročišćavanja šablonske nukleinske kiseline jedna je od ključnih karika za uspjeh ili neuspjeh PCR-a.Tradicionalne metode pročišćavanja DNK obično koriste SDS i proteazu K za probavu i odlaganje uzoraka.Glavne funkcije SDS-a su: otapanje lipida i proteina na staničnoj membrani, uništavajući tako staničnu membranu otapanjem membranskih proteina, i disociranje nuklearnih proteina u stanici, SDS se također može kombinirati s proteinima i taložiti;Proteaza K može hidrolizirati i probaviti proteine, posebno histone vezane s DNA, a zatim koristiti organsko otapalo fenol i kloroform za ekstrakciju proteina i drugih staničnih komponenti, te koristiti etanol ili izopropil alkohol za precipitaciju nukleinske kiseline.Ekstrahirana nukleinska kiselina može se koristiti kao obrazac za PCR reakcije.Za uzorke opće kliničke detekcije, brza i jednostavna metoda može se koristiti za otapanje stanica, liziranje patogena, probavu i uklanjanje proteina iz kromosoma u slobodne ciljne gene, te izravno upotrijebiti za PCR pojačanje.Ekstrakcija šablona RNA obično koristi gvanidin izotiocijanat ili metodu proteaze K kako bi se spriječilo da RNaza razgradi RNA.
8.Koncentracija Mg2+
Mg2+ ima značajan učinak na specifičnost i prinos PCR amplifikacije.U općoj PCR reakciji, kada je koncentracija različitih dNTP 200 umola/L, odgovarajuća koncentracija Mg2+ je 1,5 ~ 2,0 mmol/L.Koncentracija Mg2+ je previsoka, specifičnost reakcije se smanjuje, dolazi do nespecifičnog pojačanja, preniska koncentracija će smanjiti aktivnost Taq DNA polimeraze, što će rezultirati smanjenjem produkata reakcije.
Ioni magnezija utječu na nekoliko aspekata PCR-a, kao što je aktivnost DNA polimeraze, koja utječe na prinos;Drugi primjer je žarenje primera, koje utječe na specifičnost.dNTP i matrica vežu se za magnezijev ion, smanjujući količinu slobodnog magnezijevog iona potrebnog za aktivnost enzima.Optimalna koncentracija magnezijevih iona varira za različite parove primera i predloške, ali tipična početna koncentracija PCR-a s 200 μM dNTP je 1,5 mM (napomena: Za kvantitativni PCR u stvarnom vremenu koristite 3 do 5 mM otopine magnezijevih iona s fluorescentnom sondom).Više koncentracije slobodnih iona magnezija povećavaju prinos, ali također povećavaju nespecifično pojačanje i smanjuju vjernost.Kako bi se odredila optimalna koncentracija, titracije magnezijevih iona provedene su u koracima od 0,5 mM od 1 mM do 3 mM.Kako bi se smanjila ovisnost o optimizaciji magnezijevih iona, može se koristiti Platinum Taq DNA polimeraza.Platinum Taq DNA polimeraza može održavati funkciju u širem rasponu koncentracija magnezijevih iona od Taq DNA polimeraze i stoga zahtijeva manje optimizacije.
9. Aditivi za promicanje PCR-a
Optimizacija temperature žarenja, dizajna primera i koncentracije magnezijevih iona dovoljna je za visoko specifično pojačanje većine predložaka;međutim, neki predlošci, uključujući one s visokim GC sadržajem, zahtijevaju dodatne mjere.Aditivi koji utječu na temperaturu taljenja DNA pružaju još jedan način za poboljšanje specifičnosti proizvoda i prinosa.Za najbolje rezultate potrebna je potpuna denaturacija predloška.
Osim toga, sekundarna struktura sprječava vezanje početnica i produljenje enzima.
PCR aditivi, uključujući formamid, DMSO, glicerin, betain i PCRx Enhancer Solution, pospješuju umnožavanje.Njihov mogući mehanizam je smanjiti temperaturu taljenja, čime se pomaže žarenje početnica i pomaže ekstenzija DNA polimeraze kroz područje sekundarne strukture.PCRx otopina ima i druge prednosti.Minimalna optimizacija magnezijevih iona potrebna je kada se koristi s Platinum Taq DNA polimerazom i Platinum Pfx DNA polimerazom.Stoga se tehnika Platinum kombinira s aditivom za povećanje specifičnosti uz smanjenje ovisnosti o trećem pristupu, optimizaciji magnezijevih iona.Za najbolje rezultate treba optimizirati koncentraciju aditiva, posebice DMSO, formamida i glicerola, koji inhibiraju Taq DNA polimerazu.
10. Vrući početak
Hot start PCR jedna je od najvažnijih metoda za poboljšanje specifičnosti PCR-a uz dobar dizajn primera.Iako je optimalna temperatura elongacije Taq DNA polimeraze 72 ℃, polimeraza ostaje aktivna na sobnoj temperaturi.Stoga se nespecifični proizvodi proizvode kada je temperatura držanja niža od temperature žarenja tijekom pripreme PCR reakcije i na početku toplinskog ciklusa.Jednom kada se formiraju, ti se nespecifični proizvodi učinkovito pojačavaju.Hot-start PCR je posebno učinkovit kada su mjesta koja se koriste za dizajn primera ograničena lokacijom genetskih elemenata, kao što su mutacije usmjerene na mjesto, kloniranje ekspresije ili konstrukcija i manipulacija genetskih elemenata koji se koriste za DNK inženjering.
Uobičajena metoda za ograničavanje aktivnosti Taq DNA polimeraze je priprema PCR reakcijske otopine na ledu i stavljanje u prethodno zagrijani PCR aparat.Ova metoda je jednostavna i jeftina, ali ne dovršava aktivnost enzima i stoga ne eliminira u potpunosti pojačavanje nespecifičnih produkata.
Toplinska priprava odgađa sintezu DNA inhibiranjem bitne komponente dok PCR aparat ne dosegne temperaturu denaturacije.Većina ručnih metoda termičke inicijacije, uključujući odgođeno dodavanje Taq DNA polimeraze, glomazne su, posebno za aplikacije s visokim protokom.Druge metode termičkog prajminga koriste zaštitu od voska da zatvore bitnu komponentu, uključujući ione magnezija ili enzime, ili da fizički izoliraju reaktivne komponente, kao što su predlošci i puferi.Tijekom toplinskog ciklusa, različite komponente se oslobađaju i miješaju zajedno dok se vosak topi.Poput metode ručnog vrućeg pokretanja, metoda zaštite od voska je glomazna i sklona kontaminaciji te nije prikladna za primjene s velikom propusnošću.
Platinum DNA polimeraza je prikladna i učinkovita za automatski vrući start PCR.Platinum Taq DNA polimeraza sastoji se od rekombinantne Taq DNA polimeraze u kombinaciji s monoklonskim protutijelom protiv Taq DNA polimeraze.Protutijela su formulirana PCR-om da inhibiraju aktivnost enzima tijekom produljenog držanja temperature.Taq DNA polimeraza je puštena u reakciju tijekom izolacije od 94 ℃ koraka denaturacije, obnavljajući punu aktivnost polimeraze.Za razliku od kemijski modificirane Taq DNA polimeraze za toplinsku inicijaciju, platinasti enzim ne zahtijeva produljenu izolaciju na 94 ℃ (10 do 15 minuta) za aktiviranje polimeraze.S PlatinumTaq DNA polimerazom, 90% aktivnosti Taq DNA polimeraze je obnovljeno nakon 2 minute na 94 ℃.
11. Nest-PCR
Uzastopni krugovi amplifikacije korištenjem ugniježđenih početnica mogu poboljšati specifičnost i osjetljivost.Prva runda je standardna amplifikacija od 15 do 20 ciklusa.Mala frakcija početnog proizvoda amplifikacije razrijeđena je 100 do 1000 puta i dodana u drugu rundu amplifikacije tijekom 15 do 20 ciklusa.Alternativno, početni amplificirani produkt može se odrediti po veličini pročišćavanjem gelom.U drugom krugu amplifikacije koristi se ugniježđeni primer, koji se može vezati na ciljnu sekvencu unutar prvog primera.Korištenje ugniježđene PCR smanjuje mogućnost umnožavanja više ciljnih mjesta jer postoji nekoliko ciljnih sekvenci komplementarnih s oba skupa početnica.Isti ukupni broj ciklusa (30 do 40) s istim početnicama pojačao je nespecifična mjesta.Ugniježđeni PCR povećava osjetljivost ograničenih ciljnih sekvenci (npr. rijetkih mrna) i poboljšava specifičnost teškog PCRS-a (npr. 5′ RACE).
12. Silazni PCR
Silazni PCR poboljšava specifičnost korištenjem strogih uvjeta žarenja za prvih nekoliko ciklusa PCR-a.Ciklus počinje na temperaturi žarenja približno 5 ℃ višoj od procijenjene Tm, zatim se svaki ciklus smanjuje za 1 ℃ do 2 ℃ dok temperatura žarenja ne bude ispod Tm 5 ℃.Samo će odredišni predložak s najvećom homologijom biti pojačan.Ovi proizvodi nastavljaju se širiti u sljedećim ciklusima, istiskujući pojačane nespecifične proizvode.Silazni PCR je koristan za metode kod kojih nije poznat stupanj homologije između primera i ciljnog predloška, kao što je AFLP DNA otisak prsta.
Povezani PCR setovi
2× PCR herojTMMix sustav ima veću toleranciju na PCR inhibitore nego obični PCR Mix sustav i može se lako nositi s PCR amplificiranjem različitih složenih šablona.Jedinstveni reakcijski sustav i Taq Hero visoke učinkovitosti čine da PCR reakcija ima veću učinkovitost pojačanja, specifičnost i osjetljivost.
Veća učinkovitost pojačanja
Ima aktivnost 5'→3' DNA polimeraze i aktivnost 5'→3' egzonukleaze, bez aktivnosti 3'→5' egzonukleaze.
Real Time PCR Easyᵀᴹ-SYBR Green I Kit
Specifični—optimizirani pufer i Taq enzim za vrući početak mogu spriječiti nespecifično pojačanje i stvaranje dimera početnika
Visoka osjetljivost—može otkriti niske kopije predloška
Komplet koristi jedinstveni Foregene reagens za reverznu transkripciju i Foregene HotStar Taq DNA polimerazu u kombinaciji s jedinstvenim reakcijskim sustavom za učinkovito poboljšanje učinkovitosti pojačanja i specifičnosti reakcije.
Vrijeme objave: 9. svibnja 2023
