RT-qPCR je razvijen iz obične PCR tehnologije.Dodaje fluorescentne kemikalije (fluorescentne boje ili fluorescentne sonde) tradicionalnom PCR reakcijskom sustavu i detektira PCR žarenje i proces ekstenzije u stvarnom vremenu prema njihovim različitim luminiscentnim mehanizmima.Promjene fluorescentnog signala u mediju koriste se za izračunavanje količine promjene proizvoda u svakom ciklusu PCR-a.Trenutno su najčešće metode metoda fluorescentne boje i metoda sonde.

Metoda fluorescentne boje:
Neke fluorescentne boje, kao što su SYBR Green Ⅰ, PicoGreen, BEBO, itd., same ne emitiraju svjetlost, već emitiraju fluorescenciju nakon što se vežu za manji žlijeb dsDNA.Stoga, na početku PCR reakcije, stroj ne može otkriti fluorescentni signal.Kada reakcija prijeđe u fazu žarenja-produženja (metoda u dva koraka) ili faze produljenja (metoda u tri koraka), dvostruki lanci se otvaraju u to vrijeme, a nova DNA polimeraza Tijekom sinteze lanca, fluorescentne molekule se kombiniraju u manjem utoru dsDNA i emitiraju fluorescenciju.Kako se broj PCR ciklusa povećava, sve više i više boja se spaja s dsDNA, a fluorescentni signal se također kontinuirano pojačava.Uzmimo SYBR Green Ⅰ kao primjer.
Metoda sonde:
Taqmanova sonda je najčešće korištena sonda za hidrolizu.Postoji fluorescentna skupina na 5' kraju sonde, obično FAM.Sama sonda je sekvenca komplementarna ciljnom genu.Na 3′ kraju fluorofora nalazi se skupina za gašenje fluorescentne svjetlosti.Prema principu fluorescentnog rezonantnog prijenosa energije (Försterov rezonantni prijenos energije, FRET), kada reporterska fluorescentna skupina (donorska fluorescentna molekula) i gasna fluorescentna skupina (akceptorska fluorescentna molekula) Kada se spektar pobude preklapa, a udaljenost je vrlo blizu (7-10 nm), pobuda donorske molekule može inducirati fluorescenciju akceptorske molekule, dok je autofluorescencija oslabljena.Stoga, na početku PCR reakcije, kada je sonda slobodna i netaknuta u sustavu, reporterska fluorescentna skupina neće emitirati fluorescenciju.Prilikom žarenja, primer i sonda se vežu za šablonu.Tijekom faze produženja, polimeraza kontinuirano sintetizira nove lance.DNA polimeraza ima 5'-3' egzonukleaznu aktivnost.Kada dođe do sonde, DNA polimeraza će hidrolizirati sondu iz kalupa, odvojiti reportersku fluorescentnu skupinu od prigušivačke fluorescentne skupine i otpustiti fluorescentni signal.Budući da postoji odnos jedan-na-jedan između sonde i predloška, ​​metoda sonde je bolja od metode bojanja u smislu točnosti i osjetljivosti testa.

Slika 1 Princip qRT-PCR

Dizajn temeljnog premaza
Principi:

Početnice bi trebale biti dizajnirane u očuvanoj regiji niza nukleinskih kiselina i imati specifičnost.

Najbolje je koristiti cDNA sekvencu, a prihvatljiva je i mRNA sekvenca.Ako ne, saznajte dizajn cds regije sekvence DNA.
Duljina fluorescentnog kvantitativnog produkta je 80-150 bp, najduži je 300 bp, duljina početnice je općenito između 17-25 baza, a razlika između uzvodne i nizvodne početnice ne smije biti prevelika.

Sadržaj G+C je između 40% i 60%, a najbolji je 45-55%.
Vrijednost TM je između 58-62 stupnja.
Pokušajte izbjeći dimere početnica i samodimere, (nemojte se pojavljivati ​​više od 4 para uzastopnih komplementarnih baza) struktura ukosnice, ako je neizbježna, neka bude ΔG<4,5kJ/mol* Ako ne možete osigurati da je gDNA uklonjena tijekom obrnute transkripcije Čisto, najbolje je dizajnirati početnice introna *3′ kraj se ne može modificirati, a kako biste izbjegli regije bogate AT, GC, izbjegavajte T/C, A/G kontinuirana struktura (2-3) primera i ne-
specifična. Homologija heterogeno pojačane sekvence je poželjno manja od 70% ili ima homologiju 8 komplementarnih baza.
Baza podataka:
CottonFGD pretraživanje po ključnim riječima
Dizajn temeljnog premaza:
IDT-qPCR početni dizajn

Slika 2 IDT stranica alata za online dizajn početnika

Slika 3 prikaz stranice s rezultatima
Dizajn lncRNA početnica:
lncRNA:isti koraci kao i mRNA.
miRNA:Načelo metode stem-loop: Budući da su sve miRNA kratke sekvence od oko 23 nt, izravna PCR detekcija se ne može izvesti, pa se koristi alat za sekvencu stem-loop.Sekvenca matične petlje je jednolančana DNK od oko 50 nt, koja sama može formirati strukturu ukosnice.3 'Kraj se može dizajnirati kao sekvenca komplementarna djelomičnom fragmentu miRNA, tada se ciljna miRNA može povezati sa sekvencom matične petlje tijekom obrnute transkripcije, a ukupna duljina može doseći 70 bp, što je u skladu s duljinom umnoženog produkta određenog qPCR-om.Dizajn prajmera miRNA u repu.
Detekcija specifična za pojačanje:
Online baza podataka o eksplozijama: eksplozija CottonFGD prema sličnosti sekvenci
Lokalna eksplozija: pogledajte korištenje Blast+ za lokalnu eksploziju, linux i macos mogu izravno uspostaviti lokalnu bazu podataka, win10 sustav se također može učiniti nakon instaliranja ubuntu bash.Stvorite lokalnu bazu podataka o eksploziji i lokalnu eksploziju;otvorite ubuntu bash na win10.
Napomena: planinski pamuk i pamuk morskih otoka tetraploidni su usjevi, tako da će rezultat eksplozije često biti dva ili više podudaranja.U prošlosti je korištenje NAU cd-ova kao baze podataka za izvođenje eksplozije vjerojatno pronašlo dva homologna gena sa samo nekoliko SNP razlika.Obično se dva homologna gena ne mogu razdvojiti dizajnom početnica, pa se tretiraju kao isti.Ako postoji očiti indel, primer se obično dizajnira na indelu, ali to može dovesti do sekundarne strukture primera. Slobodna energija postaje veća, što dovodi do smanjenja učinkovitosti pojačanja, ali to je neizbježno.

Detekcija sekundarne strukture primera:
Koraci:otvorite oligo 7 → unesite niz predložaka → zatvorite podprozor → spremite → locirajte primer na predlošku, pritisnite ctrl+D za postavljanje duljine primera → analizirajte različite sekundarne strukture, kao što su samodimerizacijsko tijelo, heterodimer, ukosnica, neusklađenost, itd. Posljednje dvije slike na slici 4 su rezultati ispitivanja primera.Rezultat prednjeg primera je dobar, nema očite strukture dimera i ukosnice, nema kontinuiranih komplementarnih baza, a apsolutna vrijednost slobodne energije manja je od 4,5, dok stražnji primer pokazuje kontinuirano 6 baza je komplementarnih, a slobodna energija je 8,8;osim toga, ozbiljniji dimer se pojavljuje na 3' kraju, i pojavljuje se dimer od 4 uzastopne baze.Iako slobodna energija nije visoka, 3′ dimer Chl može ozbiljno utjecati na specifičnost pojačanja i učinkovitost pojačanja.Osim toga, potrebno je provjeriti ima li ukosnica, heterodimera i neslaganja.

Slika 3 rezultati detekcije oligo7
Detekcija učinkovitosti pojačanja:
Učinkovitost amplifikacije PCR reakcije ozbiljno utječe na rezultate PCR.Također u qRT-PCR-u, učinkovitost pojačanja posebno je važna za kvantitativne rezultate.Uklonite druge tvari, strojeve i protokole iz reakcijskog pufera.Kvaliteta početnica također ima velik utjecaj na učinkovitost amplifikacije qRT-PCR-a.Kako bi se osigurala točnost rezultata, i kvantifikacija relativne fluorescencije i kvantifikacija apsolutne fluorescencije trebaju detektirati učinkovitost pojačanja početnica.Poznato je da je učinkovita učinkovitost qRT-PCR amplifikacije između 85% i 115%.Postoje dvije metode:
1. Metoda standardne krivulje:
a.Pomiješajte cDNA
b.Gradijentno razrjeđivanje
c.qPCR
d.Jednadžba linearne regresije za izračun učinkovitosti pojačanja
2. LinRegPCR
LinRegPCR je program za analizu RT-PCR podataka u stvarnom vremenu, koji se nazivaju i kvantitativni PCR (qPCR) podaci temeljeni na SYBR Greenu ili sličnoj kemiji.Program koristi podatke koji nisu ispravljeni na osnovnoj liniji, izvodi korekciju osnovne linije na svakom uzorku zasebno, utvrđuje prozor linearnosti i zatim koristi linearnu regresijsku analizu za postavljanje ravne linije kroz PCR skup podataka.Iz nagiba ove linije izračunava se PCR učinkovitost svakog pojedinačnog uzorka.Srednja učinkovitost PCR-a po amplikonu i vrijednost Ct po uzorku koriste se za izračunavanje početne koncentracije po uzorku, izražene u proizvoljnim jedinicama fluorescencije.Unos i izlaz podataka je putem Excel tablice.Samo uzorak
potrebno je miješanje, bez gradijenta
potrebni su koraci:(Uzmite Bole CFX96 kao primjer, ne baš Stroj s jasnim ABI-jem)
eksperiment:to je standardni qPCR eksperiment.
Izlaz qPCR podataka:LinRegPCR može prepoznati dva oblika izlaznih datoteka: RDML ili rezultat kvantifikacije Amplifikacije.Zapravo, to je vrijednost detekcije u stvarnom vremenu broja ciklusa i signala fluorescencije od strane stroja, a pojačanje se dobiva analizom vrijednosti promjene fluorescencije učinkovitosti linearnog segmenta.
Izbor podataka: U teoriji, RDML vrijednost bi trebala biti upotrebljiva.Procjenjuje se da je problem mog računala u tome što softver ne može prepoznati RDML, pa imam excel izlaznu vrijednost kao izvorni podatak.Preporuča se prvo izvesti grubi pregled podataka, kao što je neuspjeh dodavanja uzoraka, itd. Točke se mogu izbrisati u izlaznim podacima (naravno, ne možete ih izbrisati, LinRegPCR će zanemariti te točke u kasnijoj fazi)

Slika 5 Izvoz qPCR podataka

Slika 6 odabir uzoraka kandidata

Unos podataka:Otvorite qualification amplification results.xls, → otvorite LinRegPCR → datoteku → pročitajte iz excela → odaberite parametre kao što je prikazano na slici 7 → OK → kliknite odredite osnovne linije

Slika 7. koraci unosa podataka linRegPCR

Proizlaziti:Ako nema ponavljanja, grupiranje nije potrebno.Ako postoji ponavljanje, grupiranje se može urediti u grupiranju uzorka, a naziv gena se unosi u identifikator, a zatim će se isti gen automatski grupirati.Na kraju kliknite na datoteku, izvezite excel i pogledajte rezultate.Prikazat će se učinkovitost pojačanja i rezultati R2 svake jažice.Drugo, ako se podijelite u grupe, prikazat će se ispravljena prosječna učinkovitost pojačanja.Uvjerite se da je učinkovitost pojačanja svake početnice između 85% i 115%.Ako je prevelik ili premalen, to znači da je učinkovitost pojačanja primera loša.

Slika 8 Rezultat i izlaz podataka

Eksperimentalni proces:
Zahtjevi kvalitete RNA:
Čistoća:1.72.0 označava da bi moglo biti zaostalog izotiocijanata.Čista nukleinska kiselina A260/A230 trebala bi biti oko 2. Ako postoji jaka apsorpcija na 230 nm, to znači da postoje organski spojevi kao što su fenatni ioni.Osim toga, može se detektirati elektroforezom u 1,5% agaroznom gelu.Usmjerite marker, jer ssRNA nema denaturaciju i logaritam molekularne težine nema linearan odnos, a molekularna težina se ne može ispravno izraziti.Koncentracija: Teoretskinemanje od 100 ng/ul, ako je koncentracija preniska, čistoća je općenito niska, a ne visoka

Slika 9 RNA gel

Osim toga, ako je uzorak dragocjen i koncentracija RNA visoka, preporuča se alikvotirati ga nakon ekstrakcije i razrijediti RNA do konačne koncentracije od 100-300 ng/ul za reverznu transkripciju.Uproces obrnute transkripcije, kada se mRNA transkribira, oligo (dt) početnice koje se mogu specifično vezati na poliA repove koriste se za obrnutu transkripciju, dok lncRNA i circRNA koriste nasumične heksamerne (Random 6 mer) početnice za obrnutu transkripciju ukupne RNA. Za miRNA, miRNA-specifične početnice vratne petlje koriste se za obrnutu transkripciju.Mnoge tvrtke sada su lansirale posebne komplete za repove.Za metodu stabljične petlje, metoda repa je prikladnija, ima veliku propusnost i štedi reagense, ali učinak razlikovanja miRNA iz iste obitelji ne bi trebao biti tako dobar kao metoda stabljične petlje.Svaki komplet za obrnutu transkripciju ima zahtjeve za koncentraciju početnica specifičnih za gen (petlje matice).Interna referenca koja se koristi za miRNA je U6.U procesu inverzije petlje stabljike, cijev U6 treba odvojeno preokrenuti, a prednji i stražnji primer U6 trebaju se dodati izravno.I circRNA i lncRNA mogu koristiti HKG kao unutarnju referencu.Udetekcija cDNA,
ako nema problema s RNA, cDNA bi također trebala biti u redu.Međutim, ako se teži savršenstvu eksperimenta, najbolje je koristiti unutarnji referentni gen (Reference gen, RG) koji može razlikovati gDNA od cd-a.Općenito, RG je gen domaćinstva., HKG) kao što je prikazano na slici 10;U to sam vrijeme radio skladišni protein soje i koristio introne koji sadrže actin7 kao internu referencu.Veličina umnoženog fragmenta ove početnice u gDNA bila je 452 bp, a ako je cDNA korištena kao kalup, bila je 142 bp.Tada su rezultati testa otkrili da je dio cDNA zapravo kontaminiran gDNA, a također je dokazano da nema problema s rezultatom obrnute transkripcije, te da se može koristiti kao obrazac za PCR.Beskorisno je izvoditi elektroforezu u agaroznom gelu izravno s cDNA, a radi se o difuznoj traci, što nije uvjerljivo.

Slika 10 detekcija cDNA

Određivanje qPCR uvjetaopćenito nema problema prema protokolu kompleta, uglavnom u koraku tm vrijednosti.Ako neki primeri nisu dobro dizajnirani tijekom dizajna primera, što rezultira velikom razlikom između vrijednosti tm i teoretskih 60°C, preporučuje se cDNA Nakon što se uzorci pomiješaju, pokrenite gradijent PCR s primerima i pokušajte izbjeći postavljanje temperature bez traka kao TM vrijednosti.

Analiza podataka

Konvencionalna metoda kvantitativne PCR obrade relativne fluorescencije u osnovi je prema 2-ΔΔCT.Predložak za obradu podataka.

Povezani proizvodi:

Jednostavan PCR u stvarnom vremenu^TM –Taqman

Jednostavan PCR u stvarnom vremenu^TM – SYBR GREEN I

RT Easy I (Master premix za sintezu prvog lanca cDNA)

RT Easy II (Master premix za sintezu prvog lanca cDNA za qPCR)