RT-qPCR je temeljni eksperiment molekularne biologije i svi ga moraju poznavati.Uglavnom uključuje tri koraka: ekstrakciju RNA, reverznu transkripciju u cDNA i fluorescentni kvantitativni PCR u stvarnom vremenu.Ne pomaže, što se događa?Vjerojatno je da postoji problem seksperiment obrnute transkripcije!Iako se čini da eksperiment obrnute transkripcije treba samo dodati RNA, dNTP, početnice ireverzna transkriptazau epruvetu centrifuge i dobro promiješajte, ali u stvarnom procesu rada još uvijek postoji mnogo detalja na koje treba obratiti pozornost.Učimo o tome!

Kako procijeniti kvalitetu RNK?
Za dobivanje cDNA, kvaliteta RNA je kritična!Kvaliteta RNA može se otkriti uglavnom iz dva aspekta:
(1) Integritet RNK:Integritet RNA može se provjeriti elektroforezom u agaroznom gelu. Uzimajući eukariote kao primjer, kompletna ukupna RNK ima tri jasne trake, molekularne težine od velike do male su 28S, 18S i 5S, a 28S je dvostruko svjetlija od 18S;ako se mogu vidjeti tri trake, ali je vrsta trake zamagljena ili Difuzija znači da je RNK djelomično degradirana.U ovom trenutku, molimo vas da odmah izvedete reakciju obrnute transkripcije i povećate unos predloška na odgovarajući način;ako se može vidjeti samo vrpca s malom molekularnom težinom ili se ne može vidjeti niti jedna vrpca, RNK je potpuno degradirana i potrebno ju je ponovno ekstrahirati.Agilent 2100 označava cjelovitost RNA s dijagramom vrhova i RIN vrijednošću.Ako je nukleinska kiselina netaknuta, baza elektroferograma je ravna;ako je nukleinska kiselina jako razgrađena, osnovna linija je neujednačena i pojavljuje se više vrhova razgradnje;vrijednost RIN-a odražava integritet RNA, u rasponu od 0-10, što je veća vrijednost, to je bolja kvaliteta RNA.Pa što je veći stupanj potpunosti.
(2) Čistoća RNA:Omjer OD260/280 može se detektirati UV spektrofotometrijom.Ako je omjer OD260/280 između 1,9 i 2,1, čistoća je vrlo dobra.
Preostala genomska DNA može dovesti do netočnih kvantitativnih rezultata
Kada se RNK ekstrahira, RNK koju dobijemo može biti pomiješana s genomskom DNK (gDNK) koja nije očišćena.Stoga će cDNA nakon obrnute transkripcije također biti pomiješana sgDNA.Tijekom nizvodnogqPCRreakcija,cDNAi gDNA se mogu umnožiti istovremeno, što rezultira relativno malom vrijednošću CT, tako da rezultati mogu biti pristrani.
Dakle, što bismo trebali učiniti u ovoj situaciji?Foregenepredlaže:
(1) Izvršite čišćenje genoma na obrnutoj RNA, koja se može ukloniti ekstrakcijom kolone tijekom ekstrakcije RNA;
(2) Tretirajte ekstrahiranu RNA s DNazomI , ali ga prekinuti s EDTA;
reagensa za reverznu transkripcijus modulima za čišćenje genoma;

Kako odabrati početnice za obrnutu transkripciju?
Početnici reverzne transkripcije također utječu na ishod reakcije reverzne transkripcije.Možete odabrati nasumične početnice, Oligo dT ili genske specifične početnice za obrnutu transkripciju prema specifičnim okolnostima eksperimenta:
(1) Specifični prijepisi: preporučuju se početnice specifične za gen;
(2) Dugi prijepisi fragmenata: Preporučuju se početnice specifične za Oligo dT/gen;
(3) Unutarnji fragmenti transkripata dugih segmenata: gen-specifični primeri/ slučajni primeri /nasumični primeri + Oligo dT.Ako se provede naknadni qPCR eksperiment, Oligo dT se ne može koristiti sam, jer korištenje samog Oligo dT može uzrokovati 3′ end bias, što dovodi do netočnih rezultata qPCR eksperimenta;
(4) miRNA: Mogu se koristiti temeljni premazi za stabljiku ili repni premazi.

Koliko puta treba razrijediti cDNA produkt reverzne transkripcije za kvantificiranje?
Nakon dobivanja cDNA produkta obrnute transkripcije, vrlo je važno koliko puta cDNA treba razrijediti za qPCR eksperimente.Ako je koncentracija cDNA previsoka ili preniska, to može utjecati na učinkovitost amplifikacije.Može li se koncentracija cDNA mjeriti i kako to učiniti?
(1) Koncentracija cDNA produkta obrnute transkripcije ne može se mjeriti, jer uz produkt cDNA, produkt obrnute transkripcije također sadrži rezidualni pufer obrnute transkripcije, reverznu transkriptazu, početnice itd., koji će ometati rezultate mjerenja koncentracije i uzrokovati nenormalan omjer OD260/280, OD260/230 i stoga ne odražava pravi prinos cDNA.U ovo vrijeme, reći će neki prijatelji, tada ću izmjeriti koncentraciju nakon pročišćavanja;ovdje Foregene želi podsjetiti da se cDNA ne preporučuje pročišćavati, jer je duljina cDNA dobivena preokretom različita, a kratka cDNA će se izgubiti u pročišćavanju.
(2) Dakle, što učiniti?Prije qPCR eksperimenta, gradijent razrjeđenja cDNA može se odrediti putem predeksperimenta.Na primjer: koristite temeljnu otopinu cDNA, 10-struko razrjeđenje i 100-struko razrjeđenje kao predloške za qPCR eksperimente i odaberite faktor razrjeđenja s CT vrijednošću u rasponu od 18-28.

Kako bi se miRNA trebale obrnuto transkribirati?
miRNA je jednolančana mala molekula RNA veličine oko 22 nt koja ne kodira protein.Zbog svoje kratke duljine, konvencionalnu qPCR metodu teško ju je izravno kvantificirati, pa je često potrebno produžiti miRNA;najčešće korištene metode reverzne transkripcije za miRNA uključuju metodu matične petlje i metodu repa.
Metoda matične petlje je produžiti miRNA dodavanjem početnica matične petlje.Ova metoda detekcije ima veću osjetljivost i specifičnost, ali je propusnost detekcije niska.Jedna obrnuta transkripcija može otkriti samo jednu miRNA i internu referencu;metoda dodavanja repa sastoji se od dva. Dovršena je zajedničkim djelovanjem dvaju enzima, a to su PolyA polimeraza i reverzna transkriptaza.PolyA polimeraza je odgovorna za dodavanje PolyA repova miRNA kako bi se povećala njezina duljina, a reverzna transkriptaza izvodi reakciju reverzne transkripcije.Ova metoda ima visoku propusnost detekcije i može detektirati više miRNA i internih referenci u jednoj obrnutoj transkripciji, ali su osjetljivost i specifičnost niske u metodi matične petlje.