U qPCR eksperimentima dizajn primera također je vrlo važna karika.Jesu li početnice prikladne ili ne usko je povezano s time doseže li učinkovitost pojačanja standard, jesu li pojačani proizvodi specifični i jesu li dostupni eksperimentalni rezultati.
Dakle, kako poboljšati specifičnost qPCR primera?Visoka učinkovitost pojačanja?
Danas ćemo vas povesti da zajedno dizajniramo qPCR početnice i neka dizajn qPCR početnica postane učinkovita vještina učenja u eksperimentima.
Prilikom dizajniranja qPCR početnica obično obratite pozornost na sljedeće točke: početnice treba dizajnirati preko introna što je više moguće, duljina proizvoda treba biti 100-300 bp, vrijednost Tm treba biti što bliža 60°C, a uzvodni i nizvodni početnici trebaju biti što je moguće bliže, a kraj početnice treba biti G ili C, itd. pričekajte.
1. Dizajn početnica koji obuhvaćaju introne
Prilikom dizajniranja qPCR početnica, odabir početnica dizajniranih preko introna može spriječiti umnožavanje gDNA predloška, ​​a proizvodi su svi izvedeni iz umnožavanja cDNA, čime se eliminira utjecaj gDNA kontaminacije.
2. Duljina temeljnog premaza
Duljina primera općenito je između 18-30 nt, a duljinu produkta umnožavanja treba kontrolirati između 100-300 bp što je više moguće.
Ako je primer prekratak, to će dovesti do nespecifične amplifikacije, a ako je predugačak, lako će stvoriti sekundarnu strukturu (kao što je struktura ukosnice).Ako je produkt amplifikacije predugačak, nije prikladan za reakciju polimeraze, što će utjecati na učinkovitost PCR amplifikacije.
3. GC sadržaj i Tm vrijednost
GC sadržaj primera treba kontrolirati između 40% i 60%.Ako je previsok ili prenizak, nije pogodan za pokretanje reakcije.GC sadržaj prednjeg i obrnutog primera trebao bi biti približno isti kako bi se dobila ista vrijednost Tm i temperatura žarenja.
Vrijednost Tm trebala bi biti između 55-65°C što je više moguće, općenito oko 60°C, a vrijednost Tm uzvodno i nizvodno trebala bi biti što je moguće bliže, po mogućnosti ne više od 4°C.
4. Izbjegavajte odabir A na 3' kraju primera
Kada je 3′ kraj primera neusklađen, postoje velike razlike u učinkovitosti sinteze različitih baza.Kada je posljednja baza A, ona također može pokrenuti lančanu sintezu čak i u slučaju neusklađenosti, a kada je posljednja baza T Kada , učinkovitost indukcije neusklađenosti je uvelike smanjena.Stoga pokušajte izbjeći odabir A na 3′ kraju primera, a bolje je odabrati T.
Ako se radi o početnoj stanici sonde, 5' kraj sonde ne može biti G, jer čak i kada je jedna G baza povezana s FAM fluorescentnom reporterskom skupinom, G također može ugasiti fluorescentni signal koji emitira FAM skupina, što rezultira lažno negativnim rezultatima.pojaviti se.
5. Bazna distribucija
Distribucija četiri baze u početnici poželjno je nasumična, izbjegavajući više od 3 uzastopna G ili C na 3' kraju, i više od 3 uzastopnaG ili C je lako generirati uparivanje u regiji sekvence bogatoj GC.
6. Područje dizajna temeljnog premaza treba izbjegavati složene sekundarne strukture.
Sekundarna struktura formirana od jednog lanca produkta pojačanja utjecat će na glatko napredovanje PCR-a.Predviđajući unaprijed postoji li sekundarna struktura u ciljnoj sekvenci, pokušajte izbjeći ovo područje u dizajnu početnica.
7. Sami početnici i između početnica trebaju pokušati izbjeći uzastopne komplementarne baze.
Ne može postojati uzastopna komplementarnost od 4 baze između samog početnica i početnice.Sam temeljni premaz ne bi trebao imati komplementarnu sekvencu, inače će se saviti i formirati strukturu ukosnice, što će utjecati na kombinaciju žarenja primera i predloška.
Komplementarne sekvence ne mogu postojati između uzvodnih i nizvodnih početnica.Komplementarnost između početnica proizvest će dimere početnica, što će smanjiti učinkovitost PCR-a i čak utjecati na kvantitativnu točnost.Ako su strukture primer-dimer i ukosnica neizbježne, vrijednost △G ne smije biti previsoka (treba biti manja od 4,5 kcal/mol).
8. Primeri pojačavaju ciljani specifični proizvod.
Krajnji cilj qPCR detekcije je razumjeti obilje ciljnog gena.Ako dođe do nespecifičnog pojačanja, kvantifikacija će biti netočna.Stoga, nakon što su primeri dizajnirani, potrebno ih je testirati pomoću BLAST-a, a specifičnost proizvoda usporediti u bazi podataka sekvenci.
Zatim, uzimamo ljudski gen GAS6 (specifičan za zaustavljanje rasta 6) kao primjer za dizajn qPCR početnica.
01 upit gen
Homo GAS6kroz NCBI.Ovdje bismo trebali obratiti pozornost na usporedbu naziva gena i vrste kako bismo bili sigurni da su dosljedni.
02 Pronađite sekvencu gena
(1) Ako je ciljna sekvenca genomska DNK, odaberite prvu, a to je sekvenca genomske DNK gena.
(2) Ako je ciljna sekvenca mRNA, odaberite drugu.Nakon unosa kliknite na “CDS” u tablici ispod.Smeđa pozadinska sekvenca je kodirajuća sekvenca gena.
03 Primeri za dizajn
Uđite u Primer-BLAST sučelje
Gore lijevo upišite redni broj gena ili slijed u Fasta formatu i ispunite odgovarajuće parametre.

Kliknite "Get primers" i NCBI će iskočiti da vam kaže da će takav odabir parametra biti proširen na druge varijante spajanja.Možemo provjeriti različite varijante spajanja i poslati ih kako bismo dobili odgovarajući par primera (kao što je prikazano na slici ispod).Ovaj proces može trajati desetke sekundi.
Temperature žarenja ovih parova primera su oko 60°C.Sukladno svrsi pokusa, odaberite početnice s umjerenom duljinom, dobrom specifičnošću i manje samokomplementacije početnica za pokus, a stopa uspješnosti je prilično visoka!
04Provjera specifičnosti primera
Zapravo, osim dizajniranja temeljnih premaza, Primer-Blast također može ocijeniti temeljne premaze koje smo sami dizajnirali.Vratite se na stranicu s dizajnom početnih spojeva, unesite uzvodne i nizvodne temeljne primjere koje smo dizajnirali, a ostali parametri neće biti prilagođeni.Nakon podnošenja možete vidjeti postoji li par primera i na drugim genima.Ako su svi oni prikazani na genu koji želimo pojačati, to znači da je specifičnost ovog para početnica velika!(Na primjer, ovo je jedini rezultat početnog upita!)

05 Procjena kvalitete temeljnog premaza
Kakav je primer "savršen" primer koji kombinira "učinkovitost pojačanja do standarda", "pojačane karakteristike proizvoda" i "pouzdane eksperimentalne rezultate"?
Učinkovitost pojačanja

krivulja taljenja
Učinkovitost amplifikacije početnica doseže 90%-110%, što znači da je učinkovitost amplifikacije dobra, a krivulja taljenja ima jedan vrh i obično Tm>80°C, što znači da je specifičnost amplifikacije dobra.
 
Povezani proizvodi:
Real Time PCR Easy–SYBR GREEN I
PCR u stvarnom vremenu Easy-Taqman