Ⅰ. Povećajte osjetljivost reakcijskog sustava:

1. Odvojite visokokvalitetnu RNA:

Uspješna sinteza cDNA dolazi od visokokvalitetne RNA.Visokokvalitetna RNA trebala bi osigurati barem ukupno dulje i ne sadrži inhibitore koji ne sadrže enzime za snimanje, kao što su EDTA ili SDS.Kvaliteta RNA određuje maksimalnu vrijednost informacije o sekvenci koju možete prepisati na cDNA.Opća metoda pročišćavanja RNA je korak metoda korištenja izocijanata/acidofenola.Kako bi se spriječilo onečišćenje RNazom, RNA izdvojena iz uzorka bogatog RNazom (kao što je gušterača) zahtijeva skladištenje formaldehida kako bi se sačuvala visokokvalitetna RNA, što je još više potrebno za dugotrajnu pohranu.RNA ekstrahirana iz jetre štakora u osnovi se razgradila nakon tjedan dana skladištenja u vodi, dok je RNA ekstrahirana iz slezene štakora ostala stabilna nakon tri godine skladištenja u vodi.Osim toga, transkripti veći od 4 kb osjetljiviji su na degradaciju RNaze u tragovima nego mali transkripti.Kako bi se povećala stabilnost uzorka RNA za pohranjivanje, RNA se može otopiti u metalnom ionu i pohraniti na -70 °C.Tilid koji se koristi za spremanje RNK ne smije sadržavati razne predmete koji razgrađuju RNK.RNA, koja je izvedena iz gušterače, može se čuvati u metalaminu najmanje godinu dana.Kada budete spremni za korištenje RNA, možete upotrijebiti sljedeće metode za taloženje RNA: dodajte NaCl do 0,2 m i 4 puta veći volumen etanola, stavite na sobnu temperaturu 3-5 minuta i 10 000 × g centrifugirajte 5 minuta.

2. Koristite reverznu transkriptazu bez aktivnosti RNaseH (RNaseH-):

Inhibitori RNaze često se dodaju reakcijama obrnute transkripcije kako bi se povećala duljina i prinos sinteze cDNA.Inhibitor RNaze dodaje se u prvoj reakciji lančane sinteze u prisutnosti pufera i redukcijskih sredstava kao što je DTT jer proces sinteze prije cDNA denaturira inhibitor, čime se oslobađaju vezane RNaze koje razgrađuju RNA.Inhibitor proteinske RNaze samo sprječava razgradnju RNK RNazom A, B, C, a ne sprječava RNazu na koži, stoga treba paziti da se RNaza ne unese s prstiju unatoč upotrebi ovih inhibitora.

Reverzna transkriptaza katalizira pretvorbu RNA u cDNA.I M-MLV i AMV imaju endogenu aktivnost RNaseH uz vlastitu aktivnost polimeraze.Aktivnost RNaseH natječe se s aktivnošću polimeraze za heterozigotne niti formirane između RNA šablona i DNA početnica ili produžnih niti cDNA, i razgrađuje RNA: RNA niti u DNA kompleksima.Predlošci RNA razgrađeni aktivnošću RNAseH više se ne mogu koristiti kao učinkoviti supstrati za sintezu cDNA, smanjujući prinos i duljinu sinteze cDNA.Stoga bi eliminacija ili znatno smanjenje aktivnosti RNaseH reverzne transkriptaze bilo od velike koristi.

SuperScriptⅡ reverzna transkriptaza, MMLV reverzna transkriptaza RNazeH- i thermoScript reverzna transkriptaza, AMV RNazeH- dale su više cDNA pune duljine nego MMLV i AMV.Na osjetljivost RT-PCR utječe količina sintetizirane cDNA.ThermoScript je puno osjetljiviji od AMV-a.Veličina RT-PCR produkata ograničena je sposobnošću reverzne transkriptaze da sintetizira cDNA, osobito kada se kloniraju veće Cdna.U usporedbi s MMLV, SuperScripⅡ značajno je povećao prinos dugih RT-PCR proizvoda.Reverzna transkriptaza RNaseH-a također povećava toplinsku stabilnost, tako da se reakcija može izvesti na temperaturama višim od normalnih od 37-42 ℃.Pod predloženim uvjetima sinteze korišteni su oligo(dT) primeri i 10μCi [alpha-p]dCTP.Ukupna proizvodnja prvog lanca izračunata je metodom taloženja TCA.CDNA pune duljine analizirana je korištenjem uklanjanja trake sortirane po veličini i brojanja u alkalnom agaroznom gelu.

3. Povećajte temperaturu očuvanja topline obrnute transkripcije:

Viša temperatura zadržavanja pomaže otvoriti sekundarnu strukturu RNA i povećati prinos reakcije.Za većinu RNA predložaka, držanje RNA i početnice na 65°C bez pufera ili soli i njihovo brzo hlađenje na ledu uklanja većinu sekundarnih struktura i omogućuje vezivanje početnica.Međutim, neki predlošci još uvijek imaju sekundarnu strukturu, čak i nakon toplinske denaturacije.Umnožavanje ovih teških predložaka može se izvesti pomoću ThermoScript reverzne transkriptaze i postavljanjem reakcije reverzne transkriptaze na više temperature kako bi se poboljšala amplifikacija.Više temperature držanja također mogu povećati specifičnost, posebno kada se sinteza cDNA izvodi korištenjem genski specifičnih početnica (GSPS) (vidi Poglavlje 3).Ako koristite GSP, provjerite je li vrijednost Tm temeljnog premaza jednaka očekivanoj temperaturi držanja.Nemojte koristiti oligo(dT) i nasumične primere iznad 60 ℃.Nasumične primere potrebno je držati na 25 ℃ 10 minuta prije povećanja na 60 ℃.Uz korištenje viših temperatura obrnute transkripcije, specifičnost se može poboljšati izravnim prijenosom mješavine RNA/primjera s temperature denaturiranja od 65 ℃ na temperaturu zadržavanja obrnute transkripcije i dodavanjem prethodno zagrijane 2× reakcijske smjese (sinteza toplinske inicijacije cDNA).Ovaj pristup pomaže spriječiti međumolekularno sparivanje baza koje se događa pri nižim temperaturama.Korištenje PCR instrumenta pojednostavljuje mnoge promjene temperature potrebne za RT-PCR.

Tth toplinski stabilizirana polimeraza djeluje kao DNA polimeraza u prisutnosti Mg2+ i RNA polimeraza u prisutnosti Mn2+.Može držati toplinu do 65 ℃.Međutim, prisutnost Mn2+ tijekom PCR-a smanjuje vjernost, što čini Tth polimerazu manje prikladnom za visoko precizno pojačanje, kao što je cDNA kloniranje.Osim toga, Tth je manje učinkovit u reverznoj transkripciji, što smanjuje osjetljivost, a budući da jedan enzim može izvesti reverznu transkripciju i PCR, kontrolne reakcije bez reverzne transkripcije ne mogu se koristiti za razlikovanje umnoženih produkata cDNA od onih kontaminirane genomske DNA.

4. Dodatak koji potiče obrnutu transkripciju:

Dodavanje aditiva, uključujući glicerin i DMSO, u reakciju prve lančane sinteze može smanjiti stabilnost dvostrukog lanca nukleinske kiseline i razmotati sekundarnu strukturu RNA.Može se dodati do 20% glicerina ili 10% DMSO bez utjecaja na aktivnost SuperScriptⅡ ili MMLV.AMV također može tolerirati do 20% glicerola bez smanjenja aktivnosti.Kako bi se povećala osjetljivost RT-PCR-a u reakciji reverzne transkripcije SuperScriptⅡ, može se dodati 10% glicerola i izolirati na 45 ℃.Ako se u PCR doda 1/10 produkta retrotranskripcijske reakcije, koncentracija glicerola u reakciji amplifikacije je 0,4%, što nije dovoljno za inhibiciju PCR-a.

5. Obrada RNaseH:

Osjetljivost se može poboljšati tretiranjem reakcija sinteze cDNA s RNazom H prije PCR-a.Za neke predloške, smatra se da RNA u reakciji sinteze cDNA sprječava vezanje amplificiranih proizvoda, u kojem slučaju tretman RNaseH može povećati osjetljivost.Općenito, liječenje RNazom H potrebno je za umnožavanje relativno dugog ciljnog predloška cDNA pune duljine, kao što je tuberozna skerozaⅡ s niskom kopijom.Za ovaj težak predložak, RNaseH je pojačao signal koji stvara cDNA sintetizirana pomoću SuperScriptⅡ ili AMV.Za većinu RT-PCR reakcija, tretman RNaseH nije obavezan jer korak PCR denaturacije izolirane na 95 ℃ obično hidrolizira RNA iz kompleksa RNA:DNA.

6. Poboljšane metode za otkrivanje malih količina RNA:

RT-PCR je posebno izazovan kada su dostupne samo male količine RNA.Dodatak glikogena kao nosača tijekom odvajanja RNA pomaže povećati prinos malih uzoraka.Glikogen bez RNaze može se dodati istovremeno s Trizolom.Glikogen je topiv u vodi i može ostati u vodenoj fazi s RNA kako bi pomogao u naknadnom taloženju.Preporučena koncentracija glikogena bez RNaze je 250 μg/ml za uzorke manje od 50 mg tkiva ili 106 kultiviranih stanica.

Dodavanje acetiliranog BSA reakcijama obrnute transkripcije pomoću SuperScriptⅡ može povećati osjetljivost, a za male količine RNA, smanjenje količine SuperScriptⅡ i dodavanje 40 jedinica inhibitora nukleaze RnaseOut može poboljšati razinu detekcije.Ako se glikogen koristi u odvajanju RNA, još uvijek se preporučuje dodavanje BSA ili inhibitora RNase za reakcije obrnute transkripcije pomoću SuperScriptⅡ.

Ⅱ. Povećajte specifičnost RT-PCR

1. Sinteza cNDA:

Tri različite metode mogu se koristiti za pokretanje sinteze prvog lanca cDNA, a relativna specifičnost svake metode utječe na količinu i vrstu sintetizirane cDNA.

Metoda slučajnog uzorka najmanje je specifična od tri metode.Primeri se žare na više mjesta u cijelom transkriptu kako bi se proizvela kratka cDNA djelomične duljine.Ova se metoda često koristi za dobivanje 5' terminalnih sekvenci i cDNA iz RNA šablona sa sekundarnim strukturnim regijama ili sa terminirajućim mjestima koja reverzna transkriptaza ne može replicirati.Da bi se dobila najduža cDNA, potrebno je empirijski odrediti omjer početnica i RNA u svakom uzorku RNA.Početna koncentracija nasumičnih primera kreće se od 50 do 250 ng po 20 μl reakcijskog sustava.Budući da je cDNA sintetizirana iz ukupne RNA korištenjem slučajnih početnica uglavnom ribosomska RNA, poli(A)+RNA se općenito odabire kao predložak.

Oligo(dT) inicijacija je specifičnija od slučajnih primera.Hibridizira se s poli(A) repom koji se nalazi na 3' kraju mRNA u većini eukariotskih stanica.Budući da poli(A)+RNA čini otprilike 1% do 2% ukupne RNA, količina i složenost cDNA mnogo je manja nego da se koriste nasumični primeri.Zbog svoje visoke specifičnosti, oligo(dT) općenito ne zahtijeva optimizaciju za omjer RNA i primera i odabir poli(A)+.Preporuča se koristiti 0,5 μg oligo(dT) po 20 μl reakcijskog sustava.oligo(dT)12-18 je prikladan za većinu RT-PCR.ThermoScript RT-PCR sustav osigurava oligo(dT)20 zbog svoje dobre toplinske stabilnosti i prikladan je za više temperature držanja.

Gene-specific primers (GSP) su najbolji specifični primeri za korak obrnute transkripcije.GSP je antisense oligonukleozid koji se može specifično hibridizirati s RNA odredišnim sekvencama, radije nego žariti sve RNA poput slučajnih početnica ili oligo(dT).Pravila koja se koriste za dizajn PCR početnica također se primjenjuju na dizajn reakcije reverzne transkripcije GSP.GSP može biti ista sekvenca kao početnica za pojačanje žarena na kraju mRNA3', ili GSP može biti dizajniran da se žari nizvodno s početnicom za obrnuto pojačanje.Za neke amplificirane objekte potrebno je dizajnirati više od jedne antisense početnice za uspješnu RT-PCR jer sekundarna struktura ciljne RNA može spriječiti vezanje početnice.Predlaže se korištenje 1 pmola antisense GSP u prvom sustavu reakcije lančane sinteze od 20 μl.

2. Povećajte temperaturu očuvanja topline obrnute transkripcije:

Kako bi se u potpunosti iskoristila specifičnost GSP-a, treba koristiti reverznu transkriptazu s visokom toplinskom stabilnošću.Toplinski stabilna reverzna transkriptaza može se izolirati na višim temperaturama kako bi se povećala oštrina reakcije.Na primjer, ako se GSP žari na 55°C, tada specifičnost GSP-a nije u potpunosti iskorištena ako se obrnuta transkripcija izvodi na 37°C s niskom strogošću pomoću AMV ili M-MLV.Međutim, SuperScripⅡ i ThermoScript mogu reagirati na 50 ℃ ili više, što eliminira nespecifične proizvode proizvedene na nižim temperaturama.Za maksimalnu specifičnost, mješavina RNA/prajmera može se prenijeti izravno s temperature denaturacije od 65 ℃ na temperaturu zadržavanja reverzne transkripcije uz dodatak prethodno zagrijane 2 x reakcijske smjese (toplinska inicijacija sinteze cDNA).To pomaže spriječiti sparivanje baza između molekula na niskim temperaturama.Korištenje PCR instrumenta pojednostavljuje mnoge temperaturne prijelaze potrebne za RT-PCR.

3. Smanjite kontaminaciju genomske DNK:

Jedna potencijalna poteškoća s RT-PCR je da RNA kontaminira genomsku DNA.Korištenje boljih metoda odvajanja RNA, kao što je Trizol reagens, smanjuje kontaminaciju genomske DNA u pripravcima RNA.Kako bi se izbjegli proizvodi proizvedeni iz genomske DNA, RNA se može tretirati s Dnas Ⅰ stupnja amplifikacije kako bi se uklonila kontaminirana DNA prije obrnute transkripcije.Uzorci su držani na 65 ℃ u 2,0 mM EDTA 10 minuta da se prekine probava DNazeⅠ.EDTA kelira magnezijeve ione kako bi spriječila hidrolizu RNK ovisnu o magnezijevim ionima koja se događa na visokim temperaturama.

Kako bi se odvojila amplificirana cDNA od produkta amplifikacije genomske DNA, mogu se dizajnirati primeri koji se zasebno žare s odvojenim egzonom.PCR proizvodi izvedeni iz cDNA bit će kraći od onih dobivenih iz kontaminirane genomske DNA.Također se provodi kontrolirani eksperiment bez obrnute transkripcije na svakoj RNA šabloni kako bi se utvrdilo je li dati fragment iz genomske DNA ili cDNA.PCR proizvodi dobiveni u odsutnosti reverzne transkripcije izvedeni su iz genoma.

Povezani proizvod

RT-PCR Jednostavno^ᵀᴹja (jedan korak)

-Komplet u jednom koraku omogućuje provođenje obrnute transkripcije i PCR-a u istoj epruveti.Samo treba dodati šablonsku RNA, specifične PCR početnice i ddH bez RNaze₂O.

-Kvantitativna analiza RNA u stvarnom vremenu može se provesti brzo i točno.

-Komplet koristi jedinstveni Foregene reagens za reverznu transkripciju i Foregene HotStar Taq DNA polimerazu u kombinaciji s jedinstvenim reakcijskim sustavom za učinkovito poboljšanje učinkovitosti pojačanja i specifičnosti reakcije.

- Optimizirani reakcijski sustav čini reakciju većom osjetljivošću detekcije, većom toplinskom stabilnosti i boljom tolerancijom.

RT Easy II (s GDNase) Glavni premiks za sintezu prvog lanca CDNA za PCR u stvarnom vremenu s GDNase

-Učinkovita sposobnost uklanjanja gDNA, koja može ukloniti gDNA u predlošku unutar 2 minute.

-Učinkovit sustav obrnute transkripcije, potrebno je samo 15 minuta da se završi sinteza prvog lanca cDNA.

-Složeni predlošci: predlošci s visokim GC sadržajem i složenom sekundarnom strukturom također se mogu preokrenuti uz visoku učinkovitost.

- Visokoosjetljivi sustav reverzne transkripcije, predlošci na razini pg također mogu dobiti cDNA visoke kvalitete.

- Sustav obrnute transkripcije ima visoku toplinsku stabilnost, optimalna temperatura reakcije je 42 ℃, a još uvijek ima dobre performanse obrnute transkripcije na 50 ℃.