一、Povećajte osjetljivost reakcijskog sustava:

1. Izolirajte visokokvalitetnu RNA:

Uspješna sinteza cDNA dolazi iz visokokvalitetne RNA.Visokokvalitetna RNA trebala bi biti barem pune duljine i bez inhibitora reverzne transkriptaze kao što su EDTA ili SDS.Kvaliteta RNA određuje maksimalnu količinu informacija o sekvenci koju možete prepisati u cDNA.Uobičajena metoda pročišćavanja RNA je metoda u jednom koraku koja koristi gvanidin izotiocijanat/kiseli fenol.Kako bi se spriječila kontaminacija količinama RNaze u tragovima, RNA izolirana iz uzoraka bogatih RNazom (kao što je gušterača) mora se pohraniti u formaldehidu kako bi se očuvala visokokvalitetna RNA, posebno za dugoročno skladištenje.RNA ekstrahirana iz jetre štakora u osnovi se razgradila nakon što je bila pohranjena u vodi tjedan dana, dok je RNA ekstrahirana iz slezene štakora ostala stabilna nakon što je bila pohranjena u vodi 3 godine.Osim toga, transkripti dulji od 4 kb osjetljiviji su na razgradnju RNazama u tragovima od malih transkripata.Kako bi se povećala stabilnost pohranjenih uzoraka RNA, RNA se može otopiti u deioniziranom formamidu i pohraniti na -70°C.Formamid koji se koristi za očuvanje RNA ne smije sadržavati ostatke koji razgrađuju RNA.RNA iz gušterače može se čuvati u formamidu najmanje godinu dana.Kada se pripremate za korištenje RNA, možete upotrijebiti sljedeću metodu za taloženje RNA: dodajte NaCl do 0,2 M i 4 puta veći volumen etanola, stavite na sobnu temperaturu 3-5 minuta i centrifugirajte na 10 000 × g 5 minuta.

2. Upotrijebite RNaseH-neaktivnu (RNaseH-) reverznu transkriptazu：

Inhibitori RNaze često se dodaju reakcijama obrnute transkripcije kako bi se povećala duljina i prinos sinteze cDNA.Inhibitori RNaze trebaju se dodati tijekom reakcije sinteze prvog lanca u prisutnosti pufera i redukcijskog sredstva (kao što je DTT), jer proces prije sinteze cDNA denaturira inhibitor, čime se oslobađa vezana RNaza koja može razgraditi RNK.Inhibitori proteinske RNaze samo sprječavaju razgradnju RNK pomoću RNaze A, B, C, a ne sprječavaju RNazu na koži, stoga pazite da ne unesete RNazu s prstiju unatoč upotrebi ovih inhibitora.

Reverzna transkriptaza katalizira pretvorbu RNA u cDNA.I M-MLV i AMV imaju endogenu aktivnost RNaseH uz vlastitu aktivnost polimeraze.Aktivnost RNaseH i aktivnost polimeraze međusobno se natječu za hibridni lanac formiran između RNA predloška i DNA početnice ili cDNA produžnog lanca, te degradiraju RNA lanac u kompleksu RNA:DNA.Predložak RNA razgrađen aktivnošću RNAseH više ne može služiti kao učinkovit supstrat za sintezu cDNA, što smanjuje prinos i duljinu sinteze cDNA.Stoga bi bilo korisno eliminirati ili znatno smanjiti aktivnost RNaseH reverzne transkriptaze.。

SuperScript Ⅱ reverzna transkriptaza, RNaseH-MMLV reverzna transkriptaza i thermoScript reverzna transkriptaza, RNaseH-AMV, mogu dobiti veću količinu i više cDNA pune duljine nego MMLV i AMV.Na osjetljivost RT-PCR-a utjecat će količina sinteze cDNA.ThermoScript je puno osjetljiviji od AMV-a.Veličina RT-PCR produkata ograničena je sposobnošću reverzne transkriptaze da sintetizira cDNA, osobito kod kloniranja većih cDNA.U usporedbi s MMLV, SuperScripⅡ značajno je povećao prinos dugih RT-PCR proizvoda.RNazaH-reverzna transkriptaza također ima povećanu termostabilnost, pa se reakcija može izvoditi na temperaturama višim od normalnih 37-42°C.Pod predloženim uvjetima sinteze, koristite oligo(dT) primer i 10 μCi [α-P]dCTP.Ukupni prinos prve niti izračunat je primjenom TCA metode taloženja.CDNA pune duljine analizirana je korištenjem vrpci sortiranih po veličini izrezanih i izbrojanih na alkalnom agaroznom gelu.

3. Povećajte temperaturu inkubacije za obrnutu transkripciju:

Viša temperatura inkubacije pomaže otvoriti sekundarnu strukturu RNA, povećavajući prinos reakcije.Za većinu RNA šablona, ​​inkubacija RNA i početnica na 65°C bez pufera ili soli, nakon čega slijedi brzo hlađenje na ledu, eliminiraće većinu sekundarnih struktura i omogućiti vezivanje početnica.Međutim, neki predlošci još uvijek imaju sekundarne strukture, čak i nakon toplinske denaturacije.Umnožavanje ovih teških predložaka može se izvesti pomoću ThermoScript reverzne transkriptaze i postavljanjem reakcije reverzne transkripcije na višu temperaturu kako bi se poboljšala amplifikacija.Više temperature inkubacije također mogu povećati specifičnost, posebno kada se za sintezu cDNA koriste genski specifični primeri (GSP) (vidi Poglavlje 3).Ako koristite GSP, osigurajte da je Tm početnica jednaka očekivanoj temperaturi inkubacije.Nemojte koristiti oligo(dT) i nasumične primere iznad 60°C.Nasumični primeri zahtijevaju inkubaciju na 25°C 10 minuta prije povećanja na 60°C.Uz korištenje više temperature obrnute transkripcije, specifičnost se također može poboljšati izravnim prijenosom mješavine RNA/primera s temperature denaturacije od 65°C na temperaturu inkubacije obrnute transkripcije i dodavanjem prethodno zagrijane 2× reakcijske smjese (cDNA hot-start synthesis) .Ovaj pristup pomaže spriječiti međumolekularno sparivanje baza koje se događa pri nižim temperaturama.Višestruko mijenjanje temperature potrebno za RT-PCR može se pojednostaviti korištenjem termociklera.

Tth termostabilna polimeraza djeluje kao DNA polimeraza u prisutnosti Mg2+ i kao RNA polimeraza u prisutnosti Mn2+.Može se čuvati na toplom na maksimalnoj temperaturi od 65°C.Međutim, prisutnost Mn2+ tijekom PCR-a smanjuje vjernost, što čini Tth polimerazu manje prikladnom za visokoprecizno pojačanje, kao što je kloniranje cDNA.Osim toga, Tth ima nisku učinkovitost reverzne transkripcije, što smanjuje osjetljivost, a budući da se reverzna transkripcija i PCR mogu izvesti s jednim enzimom, kontrolne reakcije bez reverzne transkripcije ne mogu se koristiti za usporedbu produkata amplifikacije cDNA s kontaminirajućom genomskom DNA.Produkti amplifikacije su odvojeni.

4. Dodaci koji potiču obrnutu transkripciju:

Dodaci uključujući glicerol i DMSO dodaju se u reakciju sinteze prvog lanca, što može smanjiti stabilnost dvostrukog lanca nukleinske kiseline i odvezati sekundarnu strukturu RNA.Može se dodati do 20% glicerola ili 10% DMSO bez utjecaja na aktivnost SuperScript II ili MMLV.AMV također može tolerirati do 20% glicerola bez gubitka aktivnosti.Kako bi se povećala osjetljivost RT-PCR-a u reakciji reverzne transkripcije SuperScriptⅡ, može se dodati 10% glicerola i inkubirati na 45°C.Ako se u PCR doda 1/10 produkta reakcije reverzne transkripcije, tada je koncentracija glicerola u reakciji amplifikacije 0,4%, što nije dovoljno da inhibira PCR.

5. RNaseH liječenje:

Liječenje reakcija sinteze cDNA s RNaseH prije PCR-a može povećati osjetljivost.Za neke predloške, smatra se da RNA u reakciji sinteze cDNA sprječava vezanje produkata pojačanja, u kojem slučaju tretman RNaseH može povećati osjetljivost.Općenito, tretman RNaseH je neophodan kada se amplificiraju dulji ciljni predlošci cDNA pune duljine, kao što je tuberozna sheroza II s malim brojem kopija.Za ovaj težak predložak, tretman RNaseH pojačao je signal koji proizvodi SuperScript II ili AMV-sintetizirana cDNA.Za većinu RT-PCR reakcija, tretman RNaseH nije obavezan, jer korak PCR denaturacije na 95°C općenito hidrolizira RNA u kompleksu RNA:DNA.

6. Poboljšanje metode detekcije male RNK:

RT-PCR je posebno izazovan kada su dostupne samo male količine RNA.Glikogen dodan kao nosač tijekom izolacije RNA pomaže povećati prinos malih uzoraka.Glikogen bez RNaze može se dodati istovremeno s dodavanjem Trizola.Glikogen je topiv u vodi i može se držati u vodenoj fazi s RNA kako bi se pomoglo naknadno taloženje.Za uzorke manje od 50 mg tkiva ili 106 uzgojenih stanica, preporučena koncentracija glikogena bez RNaze je 250 μg/ml.

Dodavanje acetiliranog BSA u reakciju obrnute transkripcije pomoću SuperScripta II može povećati osjetljivost, a za male količine RNA, smanjenje količine SuperScripta II i dodavanje 40 jedinica inhibitora nukleaze RNaseOut može povećati razinu detekcije.Ako se glikogen koristi u procesu izolacije RNK, još uvijek se preporučuje dodavanje BSA ili inhibitora RNaze kada se koristi SuperScript II za reakciju obrnute transkripcije.

二、Povećajte specifičnost RT-PCR

1. CND asinteza:

Sinteza prvog lanca cDNA može se započeti pomoću tri različite metode, čija relativna specifičnost utječe na količinu i vrstu sintetizirane cDNA.

Metoda nasumičnog uzorka bila je najmanje specifična od tri metode.Primeri se žare na više mjesta kroz transkript, generirajući kratke cDNA djelomične duljine.Ova se metoda često koristi za dobivanje 5' krajnjih sekvenci i za dobivanje cDNA iz RNA šablona s regijama sekundarne strukture ili s terminacijskim mjestima koja se ne mogu replicirati reverznom transkriptazom.Da bi se dobila najduža cDNA, potrebno je empirijski odrediti omjer početnica i RNA u svakom uzorku RNA.Početna koncentracija nasumičnih početnica bila je u rasponu od 50 do 250 ng po 20 μl reakcije.Budući da je cDNA sintetizirana iz ukupne RNA korištenjem slučajnih početnica primarno ribosomska RNA, poli(A)+RNA općenito se bira kao predložak.

Oligo(dT) početnice su specifičnije od slučajnih početnica.Hibridizira se s poli(A) repom koji se nalazi na 3' kraju većine eukariotskih mRNA.Budući da poli(A)+ RNA čini otprilike 1% do 2% ukupne RNA, količina i složenost cDNA mnogo je manja nego kod slučajnih početnica.Zbog svoje visoke specifičnosti, oligo(dT) općenito ne zahtijeva optimizaciju omjera RNA prema početnicama i selekciju poli(A)+.Preporuča se koristiti 0,5 μg oligo(dT) po 20 μl reakcijskog sustava.oligo(dT)12-18 je prikladan za većinu RT-PCR.ThermoScript RT-PCR sustav nudi oligo(dT)20 zbog svoje bolje toplinske stabilnosti za više temperature inkubacije.

Gene specific primers (GSP) su najspecifičniji primeri za korak obrnute transkripcije.GSP je antisense oligonukleotid koji se može specifično hibridizirati s ciljnom sekvencom RNA, za razliku od slučajnih početnica ili oligo(dT), koji se spajaju sa svim RNA.Ista pravila koja se koriste za dizajn PCR početnica primjenjuju se na dizajn GSP u reakcijama obrnute transkripcije.GSP može biti ista sekvenca kao početnica za pojačanje koja se spaja na krajnjem 3′ kraju mRNA, ili GSP može biti dizajniran da se žari nizvodno od početnice za obrnuto pojačanje.Za neke amplificirane subjekte potrebno je dizajnirati više od jedne antisense početnice za uspješnu RT-PCR jer sekundarna struktura ciljne RNA može spriječiti vezanje početnice.Preporuča se koristiti 1 pmol antisense GSP u 20 μl reakcije sinteze prvog lanca.

2. Povećajte temperaturu inkubacije za obrnutu transkripciju:

Kako bi se u potpunosti iskoristila potpuna prednost GSP specifičnosti, treba koristiti reverznu transkriptazu s većom termostabilnošću.Termostabilne reverzne transkriptaze mogu se inkubirati na višim temperaturama kako bi se povećala oštrina reakcije.Na primjer, ako se GSP žari na 55°C, specifičnost GSP-a neće biti u potpunosti iskorištena ako se AMV ili M-MLV koriste za obrnutu transkripciju pri niskoj strogosti od 37°C.Međutim, SuperScript II i ThermoScript mogu reagirati na 50°C ili višoj, što će eliminirati nespecifične proizvode koji nastaju na nižim temperaturama.Za maksimalnu specifičnost, mješavina RNA/primera može se prenijeti izravno s temperature denaturacije od 65°C na temperaturu inkubacije obrnute transkripcije i dodati u prethodno zagrijanu reakcijsku smjesu 2× (hot start sinteze cDNA).To pomaže spriječiti međumolekularno uparivanje baza na niskim temperaturama.Višestruki temperaturni prijelazi potrebni za RT-PCR mogu se pojednostaviti korištenjem termociklera.

3. Smanjuje kontaminaciju genomske DNK:

Potencijalna poteškoća s kojom se susreće RT-PCR je kontaminacija genomske DNA u RNA.Korištenje dobre metode izolacije RNK, kao što je Trizol reagens, smanjit će količinu genomske DNK koja kontaminira preparat RNK.Kako bi se izbjegli produkti izvedeni iz genomske DNA, RNA se može tretirati s DNazom I stupnja amplifikacije kako bi se uklonila kontaminirajuća DNA prije obrnute transkripcije.Razgradnja DNaze I prekinuta je inkubacijom uzoraka u 2,0 mM EDTA tijekom 10 minuta na 65°C.EDTA može kelirati magnezijeve ione, sprječavajući hidrolizu RNA ovisnu o magnezijevim ionima na visokim temperaturama.

Kako bi se odvojila amplificirana cDNA od kontaminirajućih produkata amplifikacije genomske DNA, mogu se dizajnirati primeri koji svaki žare kako bi odvojili egzone.PCR proizvodi izvedeni iz cDNA bit će kraći od onih dobivenih iz kontaminirane genomske DNA.Dodatno, kontrolni eksperiment bez obrnute transkripcije proveden je na svakoj RNA šabloni kako bi se odredilo je li dati fragment izveden iz genomske DNA ili cDNA.PCR produkt dobiven bez obrnute transkripcije izveden je iz genoma.