Svi govore o principu qRT-PCR eksperimenta, dizajnu primera, interpretaciji rezultata itd., ali mislim da bih s vama trebao podijeliti eksperimentalni rad qRT-PCR.Malo je, ali radi se o rezultatima.
Prije izvođenja qRT-PCR-a, moramo jasno razumjeti vlastitu RNK i metode rada.Uostalom, naši napori usmjereni su na postizanje rezultata, a ne na jednostavno vježbanje.Dakle, prije nego što napravimo qRT-PCR, moramo utvrditi sljedeće probleme (od kojih su neki primjenjivi samo na SYBR).
1 Jeste li sigurni da vaša RNK nije degradirana?
NanoDrop 2000 može otkriti samo koncentraciju i čistoću RNA, ali ne može otkriti integritet RNA.
Vrijednost RNA (RNA Intesity Number) može odražavati cjelovitost RNA, koju detektira sustav Agilent 2100 Bioanalyzer.
Slika. Shematski dijagram RIN vrijednosti za različite uzorke RNA (eukarioti)
Međutim, laboratoriji uglavnom nemaju bioanalizator Agilent 2100.U ovom slučaju možemo detektirati putem formaldehidnog gela, ali je potreba za ukupnom količinom RNK velika, pa je najbrža metoda obična elektroforeza u gelu.Obavezno je biti u okruženju bez nukleaza, stoga je potrebno isprati spremnik za elektroforezu, sol bocu, gel nosač i češalj s DEPC vodom.Agaroza je također bez nukleaza (sve dok je svježe otvorena), a pufer za punjenje trebao bi biti svježe otvoren što je više moguće, s 1,2% gela.
Imajte na umu da gel mora biti potpuno otopljen, inače će uzrokovati nehomogene trake, kao što je prikazano u uzorku 9 na slici.Ako je napon previsok ili ako radi predugo, to će generirati toplinu i uzrokovati degradaciju RNA, tako da napon i vrijeme treba razumno kontrolirati.Osim toga, propuštanje gela također može dodatno utvrditi postoji li ostatak DNK u uzorku i promatrati postoji li veliki broj zadržanih traka u posudi za točenje.
Lik.Detekcija RNK gel elektroforezom
2 Jeste li sigurni u koncentraciju vaše cDNA?
Iskustvo velike braće u laboratoriju je da se cDNA sustava od 20 ul dobivena svakom inverzijom izravno razrijedi 20X, dok se postdoktorske sestre razrijede 10X.Obično ovisim o situaciji.Budući da je kvaliteta RNK koju spominje svaka osoba drugačija, razina poništavanja također je različita, a tehnologija poništavanja možda neće biti stabilna.
Dakle, svaki put kad dobijem obrnutu cDNA, prvo ću je razrijediti otprilike 3 puta, a zatim ću upotrijebiti kućni gen za RT-PCR, broj ciklusa je općenito 25 ciklusa, kako bih identificirao specifičnu koncentraciju, a zatim odredio konačni faktor razrjeđenja.
3 Jeste li sigurni da su vaši primeri jednostavni za korištenje?
Može proći krivulju taljenja qRT-PCR-a, ali to još uvijek košta.Za laboratorije bez puno novca, kada dobiju puno početnica, mogu koristiti običnu RT-PCR da vide radi li se o jednoj traci i identificiraju specifičnost početnica.Ako laboratoriju ne nedostaje novca, specifičnost svih primera može se identificirati jednom kroz krivulju taljenja.
4 Jeste li sigurni da su vaši eksperimentalni uvjeti prikladni?
SYBR treba zaštititi od jakog svjetla, stoga pokušajte isključiti gornje svjetlo kada dodajete SYBR reagens, a za dovršetak treba koristiti samo prigušeno svjetlo.
Čuvati SYBR na 4°C.Kada se koristi, lagano preokrenite gore-dolje kako biste dobro promiješali kako biste izbjegli stvaranje pjene i nemojte snažno vrtložiti.
Neke mlađe sestre vole crtati oznake na PCR ploči iz straha da ne pomiješaju uzorke, što je pogrešno.Budući da je vrlo vjerojatno da će vaši markeri utjecati na prikupljanje fluorescentnih signala, općenito preporučujem juniorima da koriste eksperimentalne bilježnice za pomoć u pamćenju, kao što je prikazano u nastavku.
Lik.dijagram punjenja uzorka qRT-PCR
5 Jeste li sigurni da to radite kako treba?
Obavezno nosite rukavice, nosite rukavice, nosite rukavice i tri puta recite važne stvari.
Kako bih smanjio izloženost SYBR-a svjetlu, ja osobno volim prvo dodati predložak, kao što je prikazano na slici ispod.Prema iskustvu, dodavanje male količine predloška vjerojatno će uzrokovati pogreške uzorkovanja.Stoga, kako bih smanjio pogrešku uzrokovanu dodavanjem male količine predloška, obično ponovno udvostručim uzorak i udvostručim količinu prilikom dodavanja uzorka kako bih smanjio količinu dodanog H2O2.
Lik.Shematski dijagram punjenja qRT-PCR
Zatim konfigurirajte qRT-PCR sustav na sljedeći način.
Lik.Dijagram pripreme qRT-PCR sustava
NAPOMENA: Proces konfiguracije potrebno je obaviti na ledu.
Nakon dodavanja uzorka zalijepite prozirnu foliju za brtvljenje.Pokušajte ne dodirivati površinu prozirne folije za brtvljenje rukama, samo rukujte iz prostora s obje strane folije.Budući da otisci prstiju također mogu utjecati na prikupljanje fluorescentnih signala.Zatim pomoću centrifuge brzo centrifugirajte 10 s pri maloj brzini kako biste spriječili da uzorak visi na zidu.
Povezani proizvodi:
Vrijeme objave: 28. travnja 2023
