COVID-19 je zarazna bolest uzrokovana teškim akutnim respiratornim sindromom Coronavirus tipa 2. Kada je osoba zaražena, najčešći simptomi uključuju temperaturu, kašalj i otežano disanje.

Uzorci koji se koriste za testiranje mogu se uzeti nazofaringealnim brisevima ili orofaringealnim brisevima.

Što je PCR?

Standardna metoda otkrivanja koronavirusa je lančana reakcija polimerazom, PCR.Ovo je metoda koja se široko koristi u molekularnoj biologiji.Može brzo kopirati milijune do milijarde specifičnih fragmenata DNK.

Novi koronavirus sadrži vrlo dugačak jednolančani RNA genom.Kako bi se otkrili ti virusi PCR-om, molekule RNA moraju se pretvoriti u svoje komplementarne sekvence DNA reverznom transkriptazom, a zatim se novosintetizirana DNA može umnožiti standardnim PCR postupcima, koji su poznatiji kao RT-PCR.

RT-PCR proces

ekstrakcija RNA

Da bi se izvršila ova metoda, virusna RNA bi se trebala ekstrahirati.Razni setovi za pročišćavanje RNA mogu se koristiti za praktično, brzo i učinkovito odvajanje.

Kako biste ekstrahirali virusnu RNK pomoću komercijalnog pribora, prvo dodajte uzorak u epruvetu mikrocentrifuge, a zatim ga pomiješajte s puferom za lizu.Ovaj pufer je visoko denaturiran i obično se sastoji od fenola i gvanidin izotiocijanata.Dodatno, inhibitori RNaze obično su prisutni u puferu za lizu kako bi se osigurala izolacija intaktne virusne RNK.

Nakon dodavanja pufera za lizu, promiješajte epruvetu za miješanje pulsom i inkubirajte na sobnoj temperaturi.Virus se zatim lizira pod visoko denaturirajućim uvjetima koje osigurava pufer za lizu.

Nakon što se uzorak lizira, epruveta centrifuge koristi se za postupak pročišćavanja.Uzorak se stavlja u epruvetu centrifuge i potom centrifugira.

Ovaj postupak je metoda ekstrakcije čvrste faze u kojoj se stacionarna faza sastoji od matrice silikagela.

Pod optimalnim uvjetima soli i pH, molekule RNA vežu se na silika membranu.

Istovremeno se uklanjaju proteini i drugi kontaminanti.

Nakon centrifugiranja, stavite epruvetu za centrifugu u čistu epruvetu za sakupljanje, odbacite filtrat i zatim dodajte pufer za pranje.

Ponovno stavite epruvetu u centrifugu kako biste potisnuli pufer za pranje kroz membranu.Ovo će ukloniti sve preostale nečistoće s membrane, ostavljajući samo RNA vezanu za silikagel.

Nakon što se uzorak ispere, stavite epruvetu u čistu epruvetu mikrocentrifuge i dodajte pufer za eluiranje.

Zatim se centrifugira kako bi se elucijski pufer protjerao kroz membranu.Pufer za ispiranje uklanja virusnu RNK iz spin kolone i dobiva pročišćenu RNK bez proteina, inhibitora i drugih kontaminanata.

KORAK 2

Mješoviti koncentrat

Nakon ekstrakcije virusne RNK, sljedeći korak je priprema reakcijske smjese za PCR amplifikaciju.U ovom koraku koristi se koncentrat.Ova koncentrirana otopina je prethodno pomiješana koncentrirana otopina koja se sastoji od prethodne mješavine, reverzne transkriptaze, nukleotida, prednje početnice, obrnute početnice, TaqMan sonde i DNA polimeraze.

Na kraju, kako bi se dovršila ova reakcijska smjesa, dodaje se RNA predložak.Epruvete se miješaju pulsnim vorteksom, a zatim se reakcijska smjesa unosi u PCR ploču.PCR ploča obično sadrži 96 jažica i može analizirati više uzoraka u isto vrijeme.

KORAK 3

PCR pojačanje

Zatim stavite ploču u PCR stroj, koji je u biti termocikler.

RT-PCR u stvarnom vremenu koristi se za otkrivanje novog koronavirusa 2019. pojačavanjem ciljne sekvence u genu RdrRP, genu E i genu N.Izbor ciljnog gena ovisi o sekvenci početnice i sonde.

Prvi korak RT-PCR je reverzna transkripcija.Sintetizira se prvi lanac komplementarne DNA, koju pokreće PCR reverzni početnica, koja se veže na komplementarni dio genoma virusne RNA.Zatim reverzna transkriptaza dodaje nukleotide DNA na 3′ kraj početnice kako bi sintetizirala DNA komplementarnu virusnoj RNA.Temperatura i trajanje ovog koraka ovise o korištenim početnicama, ciljnoj RNK i reverznoj transkriptazi.

Zatim se primjenjuje početni korak denaturacije, što rezultira denaturacijom RNA-DNA hibrida.Ovaj korak je neophodan za aktivaciju DNA polimeraze.Istovremeno se deaktivira reverzna transkriptaza.

PCR se sastoji od niza toplinskih ciklusa.Svaki ciklus se sastoji od koraka denaturacije, žarenja i ekstenzije.

Korak denaturacije uključuje zagrijavanje reakcijske komore na 95 stupnjeva Celzijevih i njezino korištenje za denaturaciju dvolančane DNA šablone.

U sljedećem koraku, temperatura reakcije je smanjena na 58 stupnjeva Celzijusa, dopuštajući prednjem početniku da se spoji s komplementarnim dijelom svoje jednolančane DNK šablone.Temperatura žarenja izravno ovisi o duljini i sastavu temeljnog premaza.

U koraku produženja, DNK polimeraza sintetizira novi DNK lanac koji je komplementaran DNK šablonskom lancu.Dodavanjem slobodnih jezgri komplementarnih predlošku u smjeru od 5′ do 3′ od reakcijske smjese.Temperatura ovog koraka ovisi o korištenoj DNA polimerazi.

Nakon prvog ciklusa dobiva se dvolančana DNA meta.

Zatim uđite u drugi ciklus.Dvolančana DNA se denaturira kako bi se proizvele dvije jednolančane molekule DNA.

U sljedećem koraku, temperatura reakcije se snižava, početnice se spajaju sa svakim jednolančanim predloškom DNA, a Taq-man sonda se spaja s komplementarnim dijelom ciljne DNA.

TaqMan sonda sastoji se od fluorofora kovalentno vezanog za 5'kraj oligonukleotidne sonde.Kada je pobuđen izvorom svjetlosti ciklera, fluorofor emitira fluorescenciju.Osim toga, sonda se sastoji od prigušivača na 3′ kraju.Blizina reporterskog gena gasitelju sprječava detekciju fluorescencije.

U koraku produženja, DNA polimeraza sintetizira novi lanac.Kada polimeraza dospije do TaqMan sonde, njezina aktivnost endogene 5'nukleaze cijepa sondu, odvajajući boju od prigušivača.

Sa svakim ciklusom PCR-a oslobađa se više molekula boje, što rezultira povećanjem intenziteta fluorescencije proporcionalno broju sintetiziranih amplikona.

Ova metoda omogućuje procjenu broja danog niza prisutnog u uzorku.Broj dvolančanih fragmenata DNA udvostručuje se u svakom ciklusu.Stoga se PCR može koristiti za analizu vrlo malih uzoraka.

Za mjerenje fluorescentnog signala, volframove halogene lampe, pobudnog filtra, reflektora, leće, emisijskog filtra i nabojno spregnutog uređaja koristite CCD kameru.

KORAK 4 Otkrij

Za mjerenje fluorescentnog signala, volframove halogene lampe, pobudnog filtra, reflektora, leće, emisijskog filtra i nabojno spregnutog uređaja koristite CCD kameru.

Filtrirano svjetlo iz lampe reflektira reflektor, prolazi kroz sabirnu leću i fokusira se u središte svake rupice.Zatim se fluorescencija emitirana iz otvora reflektira od zrcala, prolazi kroz filtar emisije i detektira ga CCD kamera.U svakom PCR ciklusu, CCD može detektirati samopobuđeno svjetlo fluorofora.

Pretvara snimljeno svjetlo u digitalne podatke.Ova metoda se naziva PCR u stvarnom vremenu, a omogućuje praćenje napredovanja PCR reakcije u stvarnom vremenu.