PCR (lančana reakcija polimeraze) je jedna od in vitro tehnologija umnožavanja DNA, s poviješću dužom od 30 godina.

PCR tehnologiju uveo je Kary Mullis iz Cetusa, SAD, 1983. Mullis je podnio zahtjev za PCR patent 1985. i objavio prvi PCR akademski rad o znanosti iste godine.Mullis je 1993. za svoj rad dobio Nobelovu nagradu za kemiju.

Osnovni principi PCR-a

PCR može pojačati ciljne fragmente DNK više od milijun puta.Princip je pod katalizom DNA polimeraze, koristeći roditeljski lanac DNA kao predložak i specifični primer kao početnu točku za produženje.Replicira se in vitro kroz korake kao što su denaturacija, žarenje i ekstenzija.Proces DNA kćeri lanca komplementaran matičnom DNA lanca.

Standardni PCR proces podijeljen je u tri koraka:

1. Denaturacija: Koristite visoku temperaturu za odvajanje dvostrukih lanaca DNA.Vodikova veza između dvostrukih lanaca DNA prekida se na visokoj temperaturi (93-98 ℃).

2. Žarenje: Nakon što se dvolančana DNA odvoji, snizite temperaturu tako da se primer može vezati na jednolančanu DNA.

3. Ekstenzija: DNA polimeraza počinje sintetizirati komplementarne niti duž DNA niti iz vezanih početnica kada se temperatura snizi.Kada je produljenje završeno, ciklus je završen, a broj fragmenata DNK se udvostručuje

Ponavljanjem ova tri koraka 25-35 puta, broj fragmenata DNK će se eksponencijalno povećati.

Genijalnost PCR-a je u tome što se različiti primeri mogu dizajnirati za različite ciljne gene, tako da se fragmenti ciljnog gena mogu umnožiti u kratkom vremenskom razdoblju.

Do sada se PCR može podijeliti u tri kategorije, a to su obični PCR, fluorescentni kvantitativni PCR i digitalni PCR.

Prva generacija običnog PCR-a

Upotrijebite obični PCR instrument za umnožavanje za umnožavanje ciljnog gena, a zatim upotrijebite elektroforezu u agaroznom gelu za detekciju produkta, može se napraviti samo kvalitativna analiza.

Glavni nedostaci PCR prve generacije:

1. Sklon nespecifičnom pojačavanju i lažno pozitivnim rezultatima.

2. Otkrivanje traje dugo i operacija je glomazna.

3. Može se provesti samo kvalitativni test

Real-Time PCR druge generacije

Real-Time PCR, također poznat kao qPCR, koristi fluorescentne sonde koje mogu pokazati napredak reakcijskog sustava i prati nakupljanje pojačanih produkata putem nakupljanja fluorescentnih signala i prosuđuje rezultate kroz krivulju fluorescencije.Može se kvantificirati uz pomoć Cq vrijednosti i standardne krivulje.

Budući da se qPCR tehnologija provodi u zatvorenom sustavu, smanjena je vjerojatnost kontaminacije, a fluorescencijski signal se može pratiti radi kvantitativne detekcije, pa je najraširenija u kliničkoj praksi i postala je dominantna tehnologija u PCR-u.

Fluorescentne tvari koje se koriste u fluorescentnom kvantitativnom PCR-u u stvarnom vremenu mogu se podijeliti na: TaqMan fluorescentnu sondu, molekularne svjetionike i fluorescentnu boju.

1) TaqMan fluorescentna sonda:

Tijekom PCR amplifikacije dodaje se specifična fluorescentna sonda uz dodavanje para primera.Proba je oligonukleotid, a oba su kraja obilježena reporterskom fluorescentnom skupinom i fluorescentnom skupinom za gašenje.

Kada je sonda netaknuta, fluorescentni signal koji emitira reporterska skupina apsorbira skupina za gašenje;tijekom PCR pojačanja, aktivnost egzonukleaze 5'-3' enzima Taq cijepa i razgrađuje sondu, čineći reportersku fluorescentnu skupinu i gasitelj. Fluorescentna skupina je odvojena, tako da sustav za praćenje fluorescencije može primiti fluorescentni signal, to jest, svaki put kada se lanac DNA pojača, formira se fluorescentna molekula, a nakupljanje fluorescentnog signala je potpuno sinkroniziran s nastankom PCR produkta.

2) SYBR fluorescentna boja:

U sustav PCR reakcije dodaje se višak fluorescentne boje SYBR.Nakon što se SYBR fluorescentna boja nespecifično ugradi u dvostruki lanac DNA, emitira fluorescentni signal.Molekula boje SYBR koja nije ugrađena u lanac neće emitirati nikakav fluorescentni signal, čime se osigurava fluorescentni signal. Povećanje PCR proizvoda potpuno je sinkronizirano s povećanjem PCR proizvoda.SYBR se veže samo na dvolančanu DNA, tako da se krivulja taljenja može koristiti za određivanje je li PCR reakcija specifična.

3) Molekularni svjetionik:

To je dvostruko obilježena oligonukleotidna sonda petlje stabljike koja tvori ukosnu strukturu od oko 8 baza na 5 i 3 kraja.Sekvence nukleinske kiseline na oba kraja su komplementarno uparene, uzrokujući zbijenost fluorescentne skupine i skupine za gašenje.Zatvorite, neće biti fluorescencije.

Nakon što se generira PCR produkt, tijekom procesa žarenja, srednji dio molekularnog svjetionika uparuje se sa specifičnom sekvencom DNK, a fluorescentni gen se odvaja od gena za gašenje radi proizvodnje fluorescencije.

Glavni nedostaci druge generacije PCR-a:

Osjetljivost još uvijek nedostaje, a detekcija uzoraka niske kopije je neprecizna.

Postoji utjecaj pozadinske vrijednosti, a rezultat je osjetljiv na smetnje.

Kada u reakcijskom sustavu postoje PCR inhibitori, rezultati detekcije su osjetljivi na smetnje.

Treća generacija digitalnog PCR-a

Digitalni PCR (DigitalPCR, dPCR, Dig-PCR) izračunava broj kopija ciljne sekvence putem detekcije krajnje točke i može izvesti točnu apsolutnu kvantitativnu detekciju bez korištenja internih kontrola i standardnih krivulja.

Digitalni PCR koristi detekciju krajnje točke i ne ovisi o vrijednosti Ct (prag ciklusa), tako da je digitalna PCR reakcija pod manjim utjecajem učinkovitosti pojačanja, a tolerancija na inhibitore PCR reakcije je poboljšana, uz visoku točnost i ponovljivost.

Zbog značajki visoke osjetljivosti i visoke točnosti, inhibitori PCR reakcije ne mogu ga lako ometati i može postići pravu apsolutnu kvantifikaciju bez standardnih proizvoda, što je postalo žarište istraživanja i primjene.

Prema različitim oblicima reakcijske jedinice, može se podijeliti u tri glavne vrste: mikrofluidne, čip i kapljične sustave.

1) Mikrofluidni digitalni PCR, mdPCR:

Na temelju mikrofluidne tehnologije odvaja se predložak DNK.Mikrofluidna tehnologija može realizirati nano nadogradnju uzorka ili generiranje manjih kapljica, ali kapljice trebaju posebnu metodu adsorpcije, a zatim kombinirati s PCR reakcijskim sustavom.mdPCR je postupno usvojen drugim metodama zamjene.

2) Digitalni PCR na bazi kapljica, ddPCR:

Upotrijebite tehnologiju generiranja kapljica vode u ulju za obradu uzorka u kapljice i podijelite reakcijski sustav koji sadrži molekule nukleinske kiseline u tisuće kapljica nanorazmjera, od kojih svaka ne sadrži ciljnu molekulu nukleinske kiseline koju treba detektirati ili sadrži jednu do nekoliko ciljnih molekula nukleinske kiseline koje treba testirati.

3) Digitalni PCR na bazi čipa, cdPCR:

Upotrijebite tehnologiju integriranog puta tekućine za graviranje mnogih mikroepruveta i mikrošupljina na silikonskim pločicama ili kvarcnom staklu, i kontrolirajte protok otopine kroz različite kontrolne ventile, te podijelite tekućinu uzorka u nanometre iste veličine u reakcijske jažice za digitalnu PCR reakciju za postizanje apsolutne kvantifikacije.

Glavni nedostaci treće generacije PCR-a:

Oprema i reagensi su skupi.

Zahtjevi za kvalitetu predloška su visoki.Ako količina predloška premašuje količinu mikrosustava, bit će nemoguće kvantificirati, a ako je premala, točnost kvantifikacije će biti smanjena.

Lažno pozitivni rezultati također se mogu generirati kada postoji nespecifična amplifikacija.