PCR, višestruki PCR, In situ PCR, Obrnuti PCR, RT-PCR, qPCR（1）–PCR

Razvrstat ćemo koncepte, korake i detalje raznih PCR-a

Ⅰ. PCR

Lančana reakcija polimeraze, poznata kao PCR, je molekularna biološka tehnologija koja se koristi za povećanje specifičnih fragmenata DNK.Može se smatrati posebnom replikacijom DNK in vitro.DNA polimeraza (DNA Polymerase I) otkrivena je još 1955. godine, a Klenow fragment E. Coli, koji ima eksperimentalnu vrijednost i praktičnost, otkrio je dr. H. Klenow ranih 1970-ih, ali budući da ovaj enzim ne podnosi temperaturu, visoka ga temperatura može degenerirati, pa ne ispunjava lančanu reakciju polimeraze s degeneracijom na visokoj temperaturi.Enzimi koji se danas koriste (nazvani Taq polimeraza), izolirani su iz Thermus aquaticusa, bakterije vrućeg izvora 1976. godine. Karakteristika joj je da može izdržati visoke temperature i idealan je enzim, ali se naširoko koristi nakon 1980-ih.Izvorni koncept izvornog primitivnog prototipa PCR-a sličan je popravku i kopiranju gena, što je predložio dr. KJell Kleppe 1971. godine. On je objavio prvu jednostavnu i kratkotrajnu kopiju gena (slično reakcijama prva dva ciklusa PCR-a).PCR koji je danas razvijen razvio je dr. Kary B. Mullis 1983. Dr. Mullis je te godine opsluživao PE tvrtke, tako da PE ima poseban status u PCR industriji.Dr. Mullis službeno je objavio prvi srodni rad sa Saikijem i ostalima 1985. Od tada, upotreba PCR-a je tisućama milja dnevno, a može se reći da kvaliteta srodnih radova čini mnoge druge istraživačke metode neukusnima.Nakon toga, PCR tehnologija se naširoko koristi u biološkim znanstvenim istraživanjima i kliničkim primjenama, postavši najvažnija tehnologija istraživanja molekularne biologije.Mullis je također osvojio Nobelovu nagradu za kemiju 1993.

PCRNačelo

Osnovni princip PCR tehnologije sličan je prirodnom procesu replikacije DNA, a njegova specifičnost ovisi o oligonukleotidnom početnicu koji je komplementaran s oba kraja ciljne sekvence.PCR se sastoji od tri osnovna koraka reakcije degeneracije-žarenja-produženja: ①Degeneracija šablonske DNK: Nakon što se šablonska DNK zagrije na oko 93°C određeno vrijeme, dvostruka DNK otopina za dvolančanu DNK koja nastaje PCR umnožavanjem šablonske DNK napušta se kao jednolanac tako da se može kombinirati s početnicom za pripremu za sljedeću kružnu reakciju.②Karenje (spoja) DNK predloška i početnice: Nakon što se DNK predloška zagrije i degenerira u jedan lanac, temperatura pada na oko 55°C.Komplementarna sekvenca početnice i predloška DNA jednolančana.③Proširenje početnice: DNK predložak - vezanje početnice temelji se na djelovanju TaqDNA polimeraze, s dNTP kao reakcijskim sirovim materijalom.Zadržite načelo replikacije, sintetizirajte novi polu-rezervirani lanac kopija koji nadopunjuje predložak DNK lanca i ponovite ciklus degeneracija-žarenje-proširenje tri procesa mogu dobiti više "polu-rezerviranog kopiranog lanca", a ovaj novi lanac je ponovno dostupan Postanite predložak za sljedeći ciklus.Za završetak petlje potrebno je 2-4 minute, ciljni gen se može umnožiti nekoliko milijuna puta u 2-3 sata.

StandardPCRReakcijski sustav

Pet elemenata PCR reakcije

Postoji uglavnom pet vrsta tvari uključenih u PCR reakciju, naime početnica, enzim, dNTP, šablon i pufer (potreban je Mg2+).[PCR postupak]

Standardni PCR proces podijeljen je u tri koraka

1. Degeneracija DNA (90°C-96°C): dvolančane DNA šablone pod toplinskim djelovanjem, vodikove veze se prekidaju, tvoreći jednolančanu DNA.

2. Žarenje (25 ℃ -65 ℃): Temperatura sustava se smanjuje, primer se kombinira s DNK predloškom kako bi se formirao lokalni dvolančani.

3. Ekstenzija (70 ℃ -75 ℃): Pod djelovanjem enzima Taq (oko 72 °C, najbolja aktivnost), dNTP se koristi kao sirovina, produži se od 5′ kraja primera → 3′ kraj, sinteza i predložak nadopunjuju lanac DNK.

Svaki ciklus je denaturiran, žaren i produžen, udvostručavajući sadržaj DNK.Trenutačno, zbog kratkog područja umnožavanja, neki PCR se mogu replicirati u vrlo kratkom vremenu čak i ako aktivnost enzima Taq nije optimalna, tako da se može promijeniti u dva koraka, odnosno, žarenje i ekstenzija se mogu izvesti na 60°C-65°C u isto vrijeme.Kako bi se smanjio proces podizanja i hlađenja i poboljšala brzina odziva.

Značajke PCR reakcije

● Visoka specifičnost

Specifični odlučujući čimbenici PCR odgovora su: ①Specifična kombinacija početnice i uzorka DNA.②Načelo uparivanja baza.③Odanost reakcije sinteze polimeraze TaqDNA.④Specifičnost i konzervativnost ciljnog gena.

Ispravna kombinacija primera i šablona je ključna.Vezanje početnice i predloška te produženje lanca početnice temelji se na principu slaganja alkalne baze.Lojalnost reakcija sinteze polimeraze i otpornost na visoke temperature Taq DNA polimeraze za stvaranje vezanja (spoja) predloška i početnice u reakciji se mogu izvesti na višoj temperaturi.Specifičnost kombinacije je znatno povećana.Isječak može zadržati visok stupanj ispravnosti.Odabirom ciljne genetičke regije visoke konzervativnosti i visoke konzervativnosti, njena specifičnost je veća.

● Visoka osjetljivost

Obujam proizvodnje PCR proizvoda povećava se indeksom, koji može proširiti početni predložak Pickera (PG=10-12) kako bi se povećala razina mikrokontrolera na razinu mikrograma (μg= -6).Ciljne stanice mogu se otkriti iz 1 milijuna stanica;u detekciji virusa, osjetljivost PCR-a može doseći 3 RFU (jedinice formirane prazne točke);minimalna stopa detekcije u bakterijskoj znanosti je 3 bakterije.

● Jednostavno i brzo

PCR refleksija koristi visokotemperaturnu Taq DNA polimerazu, koja dodaje reakcijsku otopinu odjednom, to jest, reakciju degeneracije-žarenja-produženja na otopini za umnožavanje DNK i posudi vodene kupelji.Općenito, reakcija amplifikacije je dovršena za 2 do 4 sata.Prošireni proizvodi općenito se analiziraju električnim mačem i ne moraju koristiti izotope, nemaju radioaktivno zagađenje i laku promociju.

● Čistoća uzorka je niska

Nema potrebe za odvajanjem virusa ili bakterija i kulture stanica.Sirovi proizvodi DNA i RNA mogu se koristiti kao pojačivači.Detekcija pojačanja DNK može se koristiti izravno pomoću kliničkih uzoraka kao što su krv, tjelesna tekućina, tekućina za ispiranje kašlja, kosa, stanice i živo tkivo.

PCRuobičajeni problemi

● Lažno negativan, nema pojačanih traka

Ključne faze PCR reakcije uključuju: ① pripremu predložaka nukleinskih kiselina, ② kvalitetu i specifičnost početnica, ③ kvalitetu enzima ④ uvjete PCR ciklusa.Pronalaženje razloga također treba analizirati i proučiti za gore navedene veze.

Predlošci: ① Predložak sadrži razne proteine, ② Predložak sadrži inhibitor enzima Taq, 3Blanak u predlošku nije eliminiran, posebno protein skupine u kromosomu.⑤ Deminer degeneracija nukleinske kiseline nije temeljita.Kada je kvaliteta enzima i početnica dobra, nema pojasa pojačanja, što je najvjerojatnije probavni tretman uzoraka.Nešto nije u redu s postupkom ekstrakcije nukleinske kiseline predloška, ​​tako da bi se pripremila učinkovita i stabilna otopina za probavu, njezin postupak treba biti fiksiran, a ne samovoljno mijenjan.

Inaktivacija enzima: novi enzim ili i stari i novi enzimi trebaju se koristiti zajedno za analizu je li aktivnost enzima izgubljena ili nedovoljna, što dovodi do lažno negativnih rezultata.Treba napomenuti da se Taq enzim ili etidijev bromid ponekad zaborave.

Primer: kvaliteta primera, koncentracija primera i je li koncentracija dvaju primera simetrična.To je čest razlog neuspjeha PCR-a ili rastuća traka nije idealna i sklona je difuziji.Postoje problemi s kvalitetom temeljnih premaza nekih brojeva serija.Dva prajmera imaju visoku i nisku koncentraciju, uzrokujući niskoučinkovito asimetrično pojačanje.Protumjere su: ① Odaberite dobar primer za sintetiziranje jedinica.② Koncentracija primera ne ovisi samo o vrijednosti OD, već također obraća pozornost na izvornu tekućinu primera za elektroforezu agar šećernog gela.Mora postojati zona trake za temeljni premaz, a svjetlina dva temeljna premaza općenito bi trebala biti dosljedna.Pojas, PCR možda neće uspjeti u ovom trenutku i to bi trebalo riješiti jedinicom za sintezu primera.Ako je temeljni premaz visok, svjetlina je niska, a njegova koncentracija mora biti uravnotežena kada se razrijedi.③ Primer treba platiti i skladištiti u visokoj koncentraciji kako bi se spriječilo višestruko smrzavanje ili dugotrajno hlađenje dijelova hladnjaka, što će uzrokovati kvarenje i degradaciju temeljnog premaza.④ Dizajn primera je nerazuman, kao što je duljina primera nedovoljna, a di klaster se formira između primera.

Koncentracija Mg2+: Koncentracija iona Mg2+ ima velik utjecaj na učinkovitost PCR amplifikacije.Prekomjerna koncentracija može smanjiti PCR pojačanje suprotnog spola.Ako je koncentracija preniska, izlaz PCR pojačanja čak će uzrokovati neuspjeh PCR pojačanja bez ekspanzijske trake.

Promjena volumena reakcije: Volumen koji se koristi u PCR amplificiranju je 20 ul, 30 ul i 50 ul ili 100 uL, veliki volumen aplikacije za PCR amplificiranje postavljen je u skladu s različitim svrhama znanstvenog istraživanja i kliničkog ispitivanja.Nakon izrade malih volumena kao što je 20 ul, potrebno je napraviti kondiciju prilikom izrade veličine, inače neće uspjeti.

Fizički razlozi: Transformacija je vrlo važna za PCR amplificiranje.Ako je temperatura degeneracije niska, vrijeme degeneracije je kratko, vjerojatno će se dogoditi u lažno negativnim rezultatima;preniska temperatura žarenja može uzrokovati nespecifično pojačanje i smanjiti učinkovitost specifičnog pojačanja.Jako utječe na kombinaciju početnica i šablona kako bi se smanjila učinkovitost PCR pojačanja.Ponekad je potrebno koristiti standardne termometre za otkrivanje varijabilnosti, žarenja i produljene temperature u produžetku ili kuhalu topljivom u vodi, što je jedan od razloga neuspjeha PCR-a.

Varijante ciljne sekvence: Ako dođe do ciljne sekvence, mutacije ili brisanja, kombinacija prototipa i predloška se kombinira ili zbog nedostatka ciljne sekvence, početnica i predložak će izgubiti komplementarnu sekvencu, a njihova PCR amplifikacija neće biti uspješna.

● Lažno pozitivno

Čini se da je vrpca PCR pojačanja u skladu s vrpcom ciljne sekvence, a ponekad je njezina vrpca urednija i viša.

Dizajn primera nije prikladan: odabrana sekvenca za pojačanje i sekvenca za nenamjensko pojačanje su homologne, tako da su kod PCR amplifikacije produkti amplificirane PCR nenamjenske sekvence.Ciljna sekvenca je prekratka ili je početnica prekratka i sklona je lažno pozitivnim.Potrebno je redizajnirati.

Unakrsno onečišćenje ciljne sekvence ili proizvoda pojačanja: Dva su razloga za ovo onečišćenje: Prvo, unakrsno onečišćenje cijelog genoma ili velikih segmenata, što dovodi do lažno pozitivnih rezultata.Ova vrsta lažno pozitivnog može se riješiti sljedećim metodama: Budite oprezni i nježni tijekom rada kako biste spriječili udisanje ciljne sekvence u pištolj za uzorkovanje ili prskanje iz centrifugalne cijevi.Osim enzima i tvari koje ne podnose visoke temperature, sve reagense ili opremu treba dezinficirati visokim pritiskom.Centrifugalne cijevi i uzorke treba koristiti odjednom.Kad je potrebno, prije dodavanja uzoraka, reakcijska epruveta i reagens izlažu se ultraljubičastim zrakama kako bi se uništila postojeća nukleinska kiselina.Drugo, mali fragmenti u onečišćenju zraka.Ovi mali fragmenti su kraći od ciljne sekvence, ali imaju određenu homologiju.Mogu se međusobno spajati.Nakon nadopunjavanja početnica, PCR proizvod se može proširiti, što će uzrokovati lažno pozitivnu proizvodnju.Može se koristiti za smanjenje ili uklanjanje nest PCR metode.

● Pojavi se nespecifična traka pojačanja

Trake koje su se pojavile nakon PCR amplifikacije nisu u skladu s očekivanom veličinom, ili su velike ili male, ili u isto vrijeme, ili u isto vrijeme, trake specifične amplifikacije i trake nespecifične amplifikacije.Pojava nespecifičnih vrpci je: Prvo, početnice su nepotpuno komplementarne ciljnoj sekvenci ili polimerizacija početnice kako bi se formirao di klaster.Drugi je da je koncentracija MG2+iona previsoka, temperatura žarenja preniska, a povezan je i broj PCR ciklusa.Drugo, kvaliteta i količina enzima.Često su enzimi nekih izvora skloni ne-posebnim vrpcama, a enzimi drugog izvora se ne pojavljuju.Ponekad dolazi i do nespecifičnog pojačanja enzima.Protumjere su: redizajniran atraktivan ako je potrebno.Smanjite količinu enzima ili zamijenite enzim drugog izvora.Smanjite količinu primarnih, odgovarajuće povećajte količinu predložaka i smanjite broj ciklusa.Pravilno povećajte temperaturu žarenja ili upotrijebite metodu dvije temperaturne točke (93°C degeneracija, žarenje i produljenje na oko 65°C).

● Pojavljuju se ljuspice ili razmazana traka

Ponekad se čini da je PCR amplifikacija primijenjena kao remen poput ljuske ili tepiha.Iz razloga, zbog prevelike količine enzima ili loše kvalitete enzima, koncentracija dNTP je previsoka, koncentracija Mg2+ je previsoka, temperatura žarenja je preniska, a broj ciklusa je prevelik.Protumjere su: ①Smanjite količinu enzima ili promijenite enzim drugog izvora.②Smanjite koncentraciju dNTP-a ③Pravilno smanjite koncentraciju Mg2+.④Povećajte količinu šablona i smanjite broj ciklusa.

Povezani proizvodi

PCR Heroᵀᴹ (s bojom)

◮ Veća vjernost: 6 puta veća od običnog Taq enzima;

◮ Veća brzina pojačanja

◮ Veća prilagodljivost predloška

◮ Veća učinkovitost pojačanja

◮ Tolerancija na okoliš je jača: postavljen na 37°C tjedan dana, održavajući više od 90% aktivnosti;

◮ Ima aktivnost 5'→3' DNA polimeraze i aktivnost 5'→3' egzonukleaze, bez aktivnosti 3'→5' egzonukleaze.

PCR Easyᵀᴹ (s bojom)

Jedinstveni reakcijski sustav i visokoučinkovita Taq DNA polimeraza čine da PCR reakcija ima veću učinkovitost pojačanja, specifičnost i osjetljivost.

RT-qPCR Easyᵀᴹ (One Step)-SYBR Green I

◮ Komplet u jednom koraku čini dvije reakcije reverzne transkripcije i qPCR-a u istoj epruveti, potrebno je samo dodati šablonsku RNA, specifične PCR početnice i ddH bez RNaze₂O.

◮ Komplet može brzo i učinkovito kvantitativno analizirati virusnu RNA ili RNA u tragovima.

◮ Komplet koristi jedinstveni Foregene reagens za reverznu transkripciju i Foregene HotStar Taq DNA polimerazu u kombinaciji s jedinstvenim reakcijskim sustavom za učinkovito poboljšanje učinkovitosti pojačanja i specifičnosti reakcije.

◮ Optimizirani reakcijski sustav čini da reakcija ima veću osjetljivost detekcije, veću toplinsku stabilnost i bolju toleranciju.

◮ RT-qPCR Jednostavno^TM(One Step)-SYBR Green I komplet dolazi s ROX internom referentnom bojom, koja se može koristiti za uklanjanje pozadine signala i grešaka signala između jažica, što je prikladno za korisnike za korištenje u različitim modelima kvantitativnih PCR instrumenata.

RT Lako^TMII (Glavni premiks za sinteza prvog lanca cDNA zaPCR u stvarnom vremenu)

-Učinkovita sposobnost uklanjanja gDNA, koja može ukloniti gDNA u predlošku unutar 2 minute.

-Učinkovit sustav obrnute transkripcije, potrebno je samo 15 minuta da se završi sinteza prvog lanca cDNA.

-Složeni predlošci: predlošci s visokim GC sadržajem i složenom sekundarnom strukturom također se mogu preokrenuti uz visoku učinkovitost.

- Visokoosjetljivi sustav reverzne transkripcije, predlošci na razini pg također mogu dobiti cDNA visoke kvalitete.

- Sustav obrnute transkripcije ima visoku toplinsku stabilnost, optimalna temperatura reakcije je 42 ℃, a još uvijek ima dobre performanse obrnute transkripcije na 50 ℃.