PCR u stvarnom vremenu, poznat i kao kvantitativni PCR ili qPCR, metoda je za praćenje i analizu PCR produkata umnožavanja u stvarnom vremenu.
Budući da kvantitativni PCR ima prednosti jednostavnog rada, brzog i praktičnog, visoke osjetljivosti, dobre ponovljivosti i niske stope kontaminacije, naširoko se koristi u medicinskom testiranju, procjeni učinkovitosti lijekova, istraživanju genske ekspresije, transgenim istraživanjima, otkrivanju gena, otkrivanju patogena, otkrivanju životinja i biljaka., ispitivanje hrane i druga polja.
Stoga, bilo da se bavite osnovnim istraživanjima u znanostima o životu, ili zaposlenici farmaceutskih tvrtki, tvrtki za uzgoj životinja, prehrambenih tvrtki, ili čak zaposlenici ulazno-izlaznih inspekcija i karantenskih ureda, odjela za praćenje okoliša, bolnica i drugih jedinica, bit ćete više ili manje izloženi ili morate znati znanje ovladavanja kvantitativnom PCR.

Princip PCR-a u stvarnom vremenu

Real Time PCR je metoda u kojoj se u PCR reakcijski sustav dodaju fluorescentne tvari, te se kvantitativnim PCR instrumentom u realnom vremenu prati intenzitet signala fluorescencije u procesu PCR reakcije, te se na kraju eksperimentalni podaci analiziraju i obrađuju.

【Krivulja pojačanja】je krivulja koja opisuje dinamički proces PCR.Krivulja pojačanja PCR-a zapravo nije standardna eksponencijalna krivulja, već sigmoidna krivulja.

[Platformska faza krivulje pojačanja]S povećanjem broja PCR ciklusa, inaktivacijom DNA polimeraze, iscrpljivanjem dNTP-a i početnica, te inhibicijom reakcije sinteze reakcijskim nusproizvodom pirofosfatom itd., PCR se ne širi uvijek eksponencijalno., i na kraju će ući u plato.

[Područje eksponencijalnog rasta krivulje pojačanja]Iako faza platoa jako varira, u određenom području područja eksponencijalnog rasta krivulje amplifikacije ponovljivost je vrlo dobra, što je vrlo važno za kvantitativnu analizu PCR-a.

[Vrijednost praga i vrijednost Ct]Postavljamo graničnu vrijednost detekcije fluorescencije na odgovarajuću poziciju u području eksponencijalnog rasta krivulje pojačanja, naime vrijednost praga (Threshold).Sjecište vrijednosti praga i krivulje pojačanja je vrijednost Ct, odnosno vrijednost Ct odnosi se na broj ciklusa (Threshold Cycle) kada je vrijednost praga dostignuta.

Grafikon ispod jasno prikazuje odnos između linije praga i krivulje pojačanja, praga i vrijednosti Ct.

【Kako kvantificirati?】

Matematičkom teorijom je dokazano da vrijednost Ct ima obrnuti linearni odnos s logaritmom broja početnih šablona.Real Time PCR prati produkte PCR amplifikacije u stvarnom vremenu i kvantificira ih tijekom eksponencijalne faze amplifikacije.

Za svaki ciklus PCR-a, DNK se eksponencijalno povećao 2 puta, i ubrzo je dosegao plato.

Pod pretpostavkom da je količina početne DNK A₀ , nakon n ciklusa, teoretska količina DNA produkta može se izraziti kao:

A _n =A ₀ ×2ⁿ

Zatim, što je veća početna količina DNA A 0, to prije količina umnoženog produkta dosegne vrijednost detekcije An, a broj ciklusa pri dostizanju An je vrijednost Ct.To jest, što je veća početna količina DNA A 0, krivulja umnožavanja ranije dostiže vrhunac, te je odgovarajući broj ciklusa n manji.

Provodimo gradijentno razrjeđenje standarda poznate koncentracije i koristimo ga kao predložak za PCR u stvarnom vremenu, a niz krivulja umnožavanja dobit će se u jednakim intervalima redoslijedom početne količine DNK od veće prema manjoj.Prema linearnom odnosu između vrijednosti Ct i logaritma broja početnih šablona, ​​a[standardna krivulja] može se stvoriti.

Zamjenom Ct vrijednosti uzorka s nepoznatom koncentracijom u standardnu ​​krivulju, može se dobiti početna količina uzorka s nepoznatom koncentracijom, što je kvantitativno načelo PCR-a u stvarnom vremenu.

Metoda detekcije Real Time PCR

Real Time PCR detektira produkte PCR pojačanja otkrivanjem intenziteta fluorescencije u reakcijskom sustavu.

Princip metode ugradnje fluorescentne boje】

Fluorescentne boje, kao što je TB Green ® , mogu se nespecifično vezati na dvolančanu DNA u PCR sustavima i fluorescirati nakon vezanja.

Intenzitet fluorescencije u reakcijskom sustavu eksponencijalno je rastao s povećanjem PCR ciklusa.Detektiranjem intenziteta fluorescencije, količina amplifikacije DNA u reakcijskom sustavu može se pratiti u stvarnom vremenu, a zatim se može obrnuto procijeniti količina početnog predloška u uzorku.

【Princip metode fluorescentne sonde】

fluorescentna sondaje sekvenca nukleinske kiseline s fluorescentnom skupinom na 5' kraju i skupinom za gašenje na 3' kraju, koja se može specifično vezati na predložak.Kada je sonda netaknuta, fluorescenciju koju emitira fluorofor gasi grupa za gašenje i ne može fluorescirati.Kada se sonda razgradi, fluorescentna tvar će disocirati i emitirati fluorescenciju.

Fluorescentna sonda se dodaje u PCR reakcijsku otopinu.Tijekom procesa žarenja, fluorescentna sonda će se vezati za određeni položaj predloška.Tijekom procesa ekstenzije, aktivnost 5′→3′ egzonukleaze enzima PCR može razgraditi fluorescentnu sondu hibridiziranu s predloškom, a fluorescentna tvar se disocira kako bi emitirala fluorescenciju.Detekcijom intenziteta fluorescencije sonde u reakcijskom sustavu može se postići svrha praćenja količine umnožavanja produkta PCR.

【Odabir metode detekcije fluorescencije】

Ako se koristi za razlikovanje sekvenci s visokom homologijom i izvođenje multipleksne PCR detekcije kao što je SNP tipizacija, metoda fluorescentne sonde je nezamjenjiva.
Za druge PCR eksperimente u stvarnom vremenu može se koristiti jednostavna, lagana i jeftina metoda fluorescentne himere.

sonde Jake specifičnosti, sposobne za multipleksni PCR

Nedostatak

Visoki zahtjevi specifičnosti za pojačanje;

multipleks PCR se ne može izvesti. Potreba za dizajnom specifičnih sondi, visoka cijena;

ponekad je dizajn sonde težak

Povezani proizvodi: