Ct vrijednost je najvažniji oblik prikaza rezultata fluorescentne kvantitativne PCR.Koristi se za izračunavanje razlika u ekspresiji gena ili broja kopija gena.Dakle, koja se Ct vrijednost kvantifikacije fluorescencije smatra razumnom?Kako osigurati učinkovit raspon vrijednosti Ct?
Što je Ct vrijednost?
Tijekom postupka pojačanja qPCR-a, odgovarajući broj ciklusa pojačanja (prag ciklusa) kada signal fluorescencije pojačanog proizvoda dosegne postavljeni prag fluorescencije.C označava ciklus, a T označava prag.Jednostavno rečeno, Ct vrijednost je broj ciklusa koji odgovara trenutku kada početna amplifikacija predloška dosegne određenu količinu produkta u qPCR-u.Takozvana “određena količina proizvoda” bit će dodatno objašnjena kasnije.
Što čini vrijednost Ct?
1. Odnos između eksponencijalnog pojačanja, količine predloška i vrijednosti Ct
U idealnom slučaju, geni u qPCR-u akumuliraju se eksponencijalnim pojačavanjem nakon određenog broja ciklusa.Odnos između broja ciklusa pojačanja i količine proizvoda je: Količina pojačanog proizvoda = količina početnog uzorka × (1+En) broj ciklusa.Međutim, qPCR reakcija nije uvijek u idealnoj situaciji.Kada količina pojačanog produkta dosegne "određenu količinu produkta", broj ciklusa u ovom trenutku je vrijednost Ct, a nalazi se u eksponencijalnom periodu pojačanja.Odnos između Ct vrijednosti i količine početnog predloška: Postoji linearni odnos između Ct vrijednosti predloška i logaritma početnog broja kopije predloška.Što je veća početna koncentracija šablona, manja je vrijednost Ct;što je niža početna koncentracija šablona, to je veća vrijednost Ct.
2. Krivulja amplifikacije, prag fluorescencije i određena količina produkta PCR
Količina produkta amplifikacije qPCR-a izravno se prikazuje u obliku fluorescentnog signala, odnosno krivulje amplifikacije.U ranoj fazi PCR-a, amplifikacija je u idealnim uvjetima, broj ciklusa je mali, akumulacija proizvoda je mala, a razina fluorescencije ne može se jasno razlikovati od pozadine fluorescencije.Nakon toga fluorescencija raste i prelazi u eksponencijalnu fazu.Količina PCR produkta može se otkriti u određenoj točki kada je PCR reakcija tek u eksponencijalnoj fazi, što se može koristiti kao "određena količina produkta", a iz toga se može zaključiti početni sadržaj predloška.Stoga je intenzitet fluorescencijskog signala koji odgovara određenoj količini produkta prag fluorescencije.
U kasnoj fazi PCR-a, krivulja pojačanja više ne pokazuje eksponencijalno pojačanje i ulazi u linearnu fazu i fazu platoa.
3. Ponovljivost Ct vrijednosti
Kada PCR ciklus dosegne broj ciklusa vrijednosti Ct, upravo je ušao u pravo eksponencijalno razdoblje pojačanja.U ovom trenutku, mala pogreška nije pojačana, tako da je ponovljivost Ct vrijednosti izvrsna, to jest, ista predloška se pojačava u različito vrijeme ili u različitim epruvetama u isto vrijeme.Amplifikacija, dobivena vrijednost Ct je konstantna.
1.Učinkovitost pojačanja En
Učinkovitost PCR amplifikacije odnosi se na učinkovitost kojom polimeraza pretvara gen koji treba umnožiti u amplikon.Učinkovitost amplifikacije kada se jedna molekula DNA transformira u dvije molekule DNA je 100%.Učinkovitost pojačanja obično se izražava kao En.Kako bi se olakšala analiza sljedećih članaka, ukratko su predstavljeni čimbenici koji utječu na učinkovitost pojačanja.
| Čimbenici utjecaja | obrazloženje | Kako suditi? |
| A. PCR inhibitori | 1. DNK uzorka sadrži tvari koje inhibiraju PCR reakciju, poput proteina ili deterdženata.2. cDNA nakon obrnute transkripcije sadrži visoku koncentraciju predloške RNA ili komponenti RT reagensa, što također može inhibirati naknadnu PCR reakciju. | 1. Postoji li onečišćenje može se procijeniti mjerenjem omjera A260/A280 i A260/A230 ili elektroforezom RNA.2. Je li cDNA razrijeđena prema određenom omjeru nakon obrnute transkripcije. |
| B. Neodgovarajući dizajn temeljnog premaza | Primeri se ne žare učinkovito | Provjerite temeljne premaze za temeljne dimere ili ukosnice, neslaganja, a ponekad i intronic dizajne. |
| C. Nepravilan dizajn programa PCR reakcije | 1. Primeri se ne mogu učinkovito žariti2. Nedovoljno oslobađanje DNA polimeraze 3. Dugotrajna aktivnost DNA polimeraze pri visokoj temperaturi smanjena | 1. Temperatura žarenja je viša od TM vrijednosti temeljnog premaza2. Vrijeme preddenaturacije je prekratko 3. Vrijeme svake faze postupka reakcije je predugo |
| D. Nedovoljno miješanje reagensa ili greške u pipetiranju | U reakcijskom sustavu, lokalna koncentracija komponenti PCR reakcije je previsoka ili neujednačena, što rezultira neeksponencijalnim pojačanjem PCR pojačanja | |
| E. Duljina amplikona | Duljina amplikona je preduga, prelazi 300 bp, a učinkovitost pojačanja je niska | Provjerite je li duljina amplikona između 80-300 bp |
| F. Utjecaj qPCR reagensa | Koncentracija DNA polimeraze u reagensu je niska ili koncentracija iona u puferu nije optimizirana, što rezultira time da aktivnost Taq enzima ne doseže maksimum | Određivanje učinkovitosti pojačanja standardnom krivuljom |
2.Raspon vrijednosti Ct
Ct vrijednosti se kreću od 15-35.Ako je vrijednost Ct manja od 15, smatra se da je amplifikacija unutar raspona osnovnog razdoblja i da prag fluorescencije nije dosegnut.U idealnom slučaju, postoji linearni odnos između vrijednosti Ct i logaritma početnog broja kopija predloška, odnosno standardne krivulje.Kroz standardnu krivulju, kada je učinkovitost amplifikacije 100%, izračunata vrijednost Ct za kvantificiranje broja pojedinačnih kopija gena je oko 35. Ako je veća od 35, početni broj kopija predloška je teoretski manji od 1, što se može smatrati besmislenim.
Za različite Ct raspone gena, zbog razlike u broju kopija gena i učinkovitosti amplifikacije u početnoj količini predloška, potrebno je napraviti standardnu krivulju za gen i izračunati linearni raspon detekcije gena.
3. Utjecajni faktori Ct vrijednosti
Iz odnosa između broja ciklusa pojačanja i količine produkta: količina pojačanog produkta = količina početnog predloška × (1+En) broj ciklusa, može se vidjeti da će u idealnim uvjetima količina početnog predloška i En imati negativan utjecaj na vrijednost Ct.Razlika u kvaliteti predloška ili učinkovitosti pojačanja uzrokovat će preveliku ili premalu vrijednost Ct.
4.Ct vrijednost je prevelika ili premala
Vrijeme objave: 22. veljače 2023
