Gubitak sluha (HL) najčešća je senzorna invalidnost kod ljudi.U razvijenim zemljama oko 80% slučajeva prelingvalne gluhoće u djece uzrokovano je genetskim čimbenicima.Najčešći su defekti jednog gena (kao što je prikazano na slici 1), za 124 genske mutacije utvrđeno je da su povezane s nesindromskim gubitkom sluha kod ljudi, a ostale su uzrokovane čimbenicima okoliša.Kohlearni implantat (elektronički uređaj postavljen u unutarnje uho koji pruža električnu stimulaciju izravno slušnom živcu) daleko je najučinkovitija opcija za liječenje teškog HL-a, dok slušni aparat (vanjski elektronički uređaj koji pretvara i pojačava zvučne valove) može pomoći pacijentima s umjerenim HL-om.Međutim, trenutno nema dostupnih lijekova za liječenje nasljedne HL (GHL).Posljednjih je godina genska terapija dobila sve veću pozornost kao obećavajući pristup liječenju disfunkcije unutarnjeg uha.

Sl. 1.Distribucija tipa varijacije povezane s gluhoćom.[1]

Nedavno su znanstvenici s Instituta Salk i Sveučilišta u Sheffieldu objavili rezultate istraživanja u Molecular Therapy – Methods & Clinical Development [2], koji su pokazali široke izglede za primjenu in vivo genske terapije nasljedne gluhoće.Uri Manor, pomoćni profesor na Institutu Salk i direktor Waitt Centra za naprednu biofotoniku, rekao je da je rođen s ozbiljnim gubitkom sluha i smatra da bi vraćanje sluha bio prekrasan dar.Njegovo prethodno istraživanje otkrilo je da je Eps8 aktinski regulatorni protein s aktivnostima vezanja i zatvaranja aktina;u kohlearnim stanicama dlaka, proteinski kompleks koji tvori Eps8 s MYO15A, WHIRLIN, GPSM2 i GNAI3 uglavnom postoji u većini. Vrhovi dugih stereocilija, koji zajedno s MYO15A lokaliziraju BAIAP2L2 na vrhovima kraćih stereocilija, potrebni su za održavanje snopova dlačica.Stoga Eps8 može regulirati duljinu stereocilija stanica dlačica, što je bitno za normalnu funkciju sluha;Brisanje ili mutacija Eps8 dovest će do kratkih stereocilija, zbog čega neće moći pravilno pretvoriti zvuk u električne signale za percepciju mozga, što zauzvrat dovodi do gluhoće..U isto vrijeme, suradnik Walter Marcotti, profesor na Sveučilištu u Sheffieldu, otkrio je da se stanice dlaka ne mogu normalno razvijati u nedostatku Eps8.U ovoj studiji, Manor i Marcotti su se udružili kako bi istražili može li dodavanje Eps8 stereocilijarnim stanicama obnoviti njihovu funkciju i, zauzvrat, poboljšati sluh kod miševa.Istraživački tim upotrijebio je vektor Anc80L65 adeno-pridruženog virusa (AAV) za isporuku kodirajuće sekvence koja sadrži divlji tip EPS8 u pužnicu Eps8-/- novorođenih P1-P2 miševa ubrizgavanjem okrugle membrane;u mišjim kohlearnim stanicama s dlačicama Funkcija stereocilija popravljena je prije nego što su sazrijele;a učinak popravka karakteriziran je tehnologijom snimanja i mjerenjem stereocilija.Rezultati su pokazali da je Eps8 povećao duljinu stereocilija i obnovio funkciju stanica dlaka u stanicama niske frekvencije.Također su otkrili da se s vremenom čini da stanice gube sposobnost spašavanja ovom genskom terapijom.Implikacija je da je ovaj tretman možda potrebno primijeniti u maternici, budući da su stanice dlaka Eps8-/- možda sazrele ili nakupile nepopravljiva oštećenja nakon što su miševi rođeni."Eps8 je protein s mnogo različitih funkcija i ima još puno toga za istražiti", rekao je Manor.Buduća istraživanja uključivat će ispitivanje učinka Eps8 genske terapije u vraćanju sluha u različitim razvojnim fazama i je li moguće produžiti mogućnosti liječenja.Igrom slučaja, u studenom 2020., profesor KarenB Avraham sa Sveučilišta Tel Aviv u Izraelu objavio je svoje rezultate u časopisu EMBO Molecular Medicine [3], koristeći inovativnu tehnologiju genske terapije za stvaranje bezopasnog sintetskog adeno-povezanog virusa AAV9-PHP.B, Defekt gena u stanicama dlaka miševa Syne4-/- popravljen je ubrizgavanjem virusa koji nosi kodirajuću sekvencu Syne4 u unutarnje uho miševa, dopuštajući mu da uđe u stanice dlaka i oslobodi preneseni genetski materijal, omogućujući im da sazriju i normalno funkcioniraju (kao na slici 2).

sl.2.Shematski prikaz anatomije unutarnjeg uha, s fokusom na Cortijev organ i staničnu funkciju nesprina-4.

Vidljivo je da korištenje genske terapije za postizanje svrhe liječenja nasljednih bolesti na genskoj razini umetanjem, uklanjanjem ili ispravljanjem bilo kojih mutiranih gena za liječenje (odnosno kontroliranje genetskih promjena u bolesti) ima visok klinički učinak.izgledi za primjenu.Sadašnje metode genske terapije za genetski manjkavu gluhoću mogu se podijeliti u sljedeće kategorije:

zamjena gena

Zamjena gena vjerojatno je "najjednostavniji" oblik genske terapije, temeljen na identificiranju i zamjeni defektnog gena normalnom ili divljom kopijom gena.Prva uspješna studija genske terapije unutarnjeg uha za gubitak sluha uzrokovan brisanjem gena vezikularnog glutamatnog transportera 3 (VGLUT3);AAV1-posredovana isporuka egzogene prekomjerne ekspresije VGLUT3 u stanicama dlačica unutarnjeg uha (IHC) može rezultirati održivim oporavkom sluha, djelomičnim oporavkom sinaptičke morfologije vrpce i konvulzivnim odgovorima [4].Međutim, u primjerima koji uključuju dvije zamjene gena isporučene AAV-om opisane u gornjem uvodu, važno je napomenuti da su mišji modeli korišteni za određene vrste nasljednih poremećaja gubitka sluha s brisanjem gena vremenski različiti od ljudskih, a kod P1 miševa unutarnje uho je u zreloj fazi razvoja.Nasuprot tome, ljudi se rađaju sa zrelim unutarnjim uhom.Ova razlika sprječava moguću primjenu rezultata miševa u liječenju ljudskih nasljednih poremećaja gluhoće osim ako se genska terapija ne primijeni na zrele mišje uši.

Uređivanje gena: CRISPR/Cas9

U usporedbi sa "zamjenom gena", razvoj tehnologije za uređivanje gena donio je početak liječenja genetskih bolesti iz korijena.Važno je da metoda uređivanja gena nadoknađuje nedostatke tradicionalnih metoda genske terapije prekomjerne ekspresije koje nisu prikladne za dominantne nasljedne bolesti gluhoće, te problem da metoda prekomjerne ekspresije ne traje dugo.Nakon što su kineski istraživači specifično nokautirali Myo6C442Y mutant alel u miševima Myo6WT/C442Y koristeći sustav za uređivanje gena AAV-SaCas9-KKH-Myo6-g2, i unutar 5 mjeseci od nokauta, miševi Slušna funkcija modela je obnovljena;u isto vrijeme, također je primijećeno da je stopa preživljavanja stanica dlačica u unutarnjem uhu poboljšana, oblik cilija postao je pravilan, a elektrofiziološki pokazatelji su korigirani [5].Ovo je prva studija u svijetu koja koristi tehnologiju CRISPR/Cas9 za liječenje nasljedne gluhoće uzrokovane mutacijom gena Myo6 te je važan napredak u istraživanju tehnologije za uređivanje gena za liječenje nasljedne gluhoće.Klinički prijevod liječenja pruža čvrstu znanstvenu osnovu.

Metode primjene genske terapije

Kako bi genska terapija bila uspješna, gole molekule DNA ne mogu učinkovito prodrijeti u stanice zbog svoje hidrofilnosti i negativnog naboja fosfatnih skupina, a kako bi se osigurao integritet dopunjenih molekula nukleinskih kiselina, mora se odabrati sigurna i učinkovita metoda.Dodatna DNK se isporučuje u ciljnu stanicu ili tkivo.AAV se široko koristi kao sredstvo za isporuku u liječenju bolesti zbog svog visokog infektivnog učinka, niske imunogenosti i širokog tropizma za različite tipove tkiva.Trenutačno je veliki broj istraživanja odredio tropizam različitih podtipova AAV u odnosu na različite tipove stanica u mišjoj pužnici.Upotrebom karakteristika isporuke AAV-a u kombinaciji s promotorima specifičnim za stanicu može se postići ekspresija specifična za stanicu, što može smanjiti neciljane učinke.Osim toga, kao alternativa tradicionalnim AAV vektorima, novi sintetski AAV vektori se stalno razvijaju i pokazuju superiornu sposobnost transdukcije u unutarnjem uhu, od kojih je AAV2/Anc80L65 najrašireniji.Nevirusne metode isporuke mogu se dalje podijeliti na fizičke metode (mikroinjekcije i elektroporacije) i kemijske metode (na bazi lipida, na bazi polimera i nanočestica zlata).Oba su pristupa korištena u liječenju nasljednih poremećaja gluhoće i pokazala su različite prednosti i ograničenja.Uz prijenosno sredstvo za gensku terapiju kao prijenosno sredstvo, mogu se primijeniti različiti pristupi za in vivo davanje gena na temelju različitih tipova ciljnih stanica, putova davanja i terapijske učinkovitosti.Zamršena struktura unutarnjeg uha otežava dopiranje do ciljnih stanica, a distribucija sredstava za uređivanje genoma je spora.Membranski labirint nalazi se unutar koštanog labirinta temporalne kosti i uključuje kohlearni kanal, polukružni kanal, maternicu i balon.Njegova relativna izoliranost, minimalna limfna cirkulacija i odvajanje od krvi barijerom krvnog labirinta ograničavaju učinkovitu sustavnu isporuku terapeutika samo neonatalnim miševima.Kako bi se dobili virusni titri prikladni za gensku terapiju, potrebna je izravna lokalna injekcija virusnih vektora u unutarnje uho.Utvrđeni putovi ubrizgavanja uključuju [6]: (1) membranu s okruglim prozorom (RWM), (2) traheostomiju, (3) endolimfatičnu ili perilimfatičnu kohleostomiju, (4) membranu s okruglim prozorom plus tube fenestration (CF) (kao na slici 3).

sl.3.Genska terapija unutarnjeg uha.

Iako su u genskoj terapiji postignuti mnogi pomaci, temeljeni na kliničkim translacijskim ciljevima, potrebno je obaviti više posla prije nego što genska terapija postane opcija prve linije liječenja za pacijente s genetskim bolestima, posebno u razvoju sigurnih i učinkovitih vektora i metode isporuke.Ali vjerujemo da će u bliskoj budućnosti ove vrste tretmana postati glavni dio personalizirane terapije i da će imati iznimno pozitivan utjecaj na živote ljudi s genetskim poremećajima i njihovih obitelji.

Foregene je također lansirao kit za probir ciljanih gena visoke propusnosti, koji je brz i može izvesti reverznu transkripciju i qPCR reakcije bez ekstrakcije RNK.

Veze proizvoda

Komplet Cell Direct RT-qPCR—Taqman/SYBR GREEN I

Za više informacija o proizvodu, molimo kontaktirajte:

overseas@foregene.com