Tehnologija molekularne dijagnostike koristi metode molekularne biologije za otkrivanje ekspresije i strukture genetskog materijala ljudskog tijela i raznih patogena, kako bi se postigla svrha predviđanja i dijagnosticiranja bolesti.

Posljednjih godina, s nadogradnjom i ponavljanjem tehnologije molekularne dijagnostike, klinička primjena molekularne dijagnostike postala je sve opsežnija i dublja, a tržište molekularne dijagnostike ušlo je u razdoblje brzog razvoja.

Autor sažima uobičajene tehnologije molekularne dijagnostike na tržištu, a podijeljen je u tri dijela: prvi dio predstavlja PCR tehnologiju, drugi dio predstavlja tehnologiju izotermne amplifikacije nukleinske kiseline, a drugi dio predstavlja tehnologiju sekvenciranja.

01

Dio I: PCR tehnologija

PCR tehnologija

PCR (lančana reakcija polimeraze) je jedna od in vitro tehnologija umnožavanja DNA, s poviješću dužom od 30 godina.

PCR tehnologiju uveo je 1983. Kary Mullis iz Cetusa, SAD.Mullis je 1985. podnio zahtjev za PCR patent i iste godine objavio prvi PCR akademski rad o znanosti.Mullis je 1993. dobio Nobelovu nagradu za kemiju.

Osnovni principi PCR-a

PCR može pojačati ciljne fragmente DNK više od milijun puta.Načelo je da se pod katalizom DNA polimeraze matični lanac DNA koristi kao predložak, a specifična početnica koristi se kao početna točka za produženje.Replicira se in vitro kroz korake kao što su denaturacija, žarenje i ekstenzija.Proces DNA kćeri lanca komplementaran matičnom DNA lanca.

Standardni PCR proces podijeljen je u tri koraka:

1. Denaturacija: Koristite visoku temperaturu za odvajanje dvostrukih lanaca DNA.Vodikove veze između dvostrukih lanaca DNA pucaju na visokim temperaturama (93-98°C).

2. Žarenje: Nakon što se dvolančana DNA odvoji, temperatura se snižava kako bi se početnica mogla vezati na jednolančanu DNA.

3. Ekstenzija: DNA polimeraza počinje sintetizirati komplementarne niti duž DNA niti iz vezanih početnica kada se temperatura snizi.Kada je produljenje završeno, ciklus je završen, a broj fragmenata DNK se udvostručuje.

Ponavljanjem ova tri koraka 25-35 puta, broj fragmenata DNK će se eksponencijalno povećati.

Genijalnost PCR-a je u tome što se različiti primeri mogu dizajnirati za različite ciljne gene, tako da se fragmenti ciljnog gena mogu umnožiti u kratkom vremenskom razdoblju.

Do sada se PCR može podijeliti u tri kategorije, a to su obični PCR, fluorescentni kvantitativni PCR i digitalni PCR.

Prva generacija običnog PCR-a

Upotrijebite obični PCR instrument za umnožavanje za umnožavanje ciljnog gena, a zatim upotrijebite elektroforezu u agaroznom gelu za detekciju produkta, može se napraviti samo kvalitativna analiza.

Glavni nedostaci PCR prve generacije:

-Sklon nespecifičnom pojačavanju i lažno pozitivnim rezultatima.

- Otkrivanje traje dugo i operacija je glomazna.

-Mogu se provesti samo kvalitativna ispitivanja.

Druga generacija fluorescentnog kvantitativnog PCR-a

Fluorescencijski kvantitativni PCR (PCR u stvarnom vremenu), također poznat kao qPCR, koristi se za praćenje akumulacije pojačanih produkata putem akumulacije fluorescentnih signala dodavanjem fluorescentnih sondi koje mogu pokazati napredak reakcijskog sustava i za procjenu rezultata kroz krivulju fluorescencije, a može se kvantificirati uz pomoć Cq vrijednosti i standardne krivulje.

Budući da se qPCR tehnologija provodi u zatvorenom sustavu, smanjena je vjerojatnost kontaminacije, a fluorescencijski signal se može pratiti radi kvantitativne detekcije, pa je najraširenija u kliničkoj praksi i postala je dominantna tehnologija u PCR-u.

Fluorescentne tvari koje se koriste u fluorescentnom kvantitativnom PCR-u u stvarnom vremenu mogu se podijeliti na: TaqMan fluorescentne sonde, molekularne svjetionike i fluorescentne boje.

1) TaqMan fluorescentna sonda:

Tijekom PCR amplifikacije dodaje se specifična fluorescentna sonda uz dodavanje para početnica.Sonda je oligonukleotid, a dva su kraja obilježena reporterskom fluorescentnom skupinom i prigušivačem fluorescentne skupine.

Kada je sonda netaknuta, fluorescentni signal koji emitira reporterska skupina apsorbira skupina za gašenje;tijekom PCR pojačanja, aktivnost egzonukleaze 5'-3' enzima Taq cijepa i razgrađuje sondu, čineći reportersku fluorescentnu skupinu i gasitelj. Fluorescentna skupina je odvojena, tako da sustav za praćenje fluorescencije može primiti fluorescentni signal, to jest, svaki put kada se lanac DNA pojača, formira se fluorescentna molekula, a nakupljanje fluorescentnog signala je potpuno sinkroniziran s nastankom PCR produkta.

2) SYBR fluorescentne boje:

U sustav PCR reakcije dodaje se višak fluorescentne boje SYBR.Nakon što se SYBR fluorescentna boja nespecifično ugradi u dvostruki lanac DNA, emitira fluorescentni signal.Molekula boje SYBR koja nije ugrađena u lanac neće emitirati nikakav fluorescentni signal, čime se osigurava fluorescentni signal. Povećanje PCR proizvoda potpuno je sinkronizirano s povećanjem PCR proizvoda.SYBR se veže samo na dvolančanu DNA, tako da se krivulja taljenja može koristiti za određivanje je li PCR reakcija specifična.

3) Molekularni svjetionici

To je dvostruko obilježena oligonukleotidna sonda petlje stabljike koja tvori ukosnu strukturu od oko 8 baza na 5 i 3 kraja.Sekvence nukleinske kiseline na oba kraja su komplementarno uparene, uzrokujući zbijenost fluorescentne skupine i skupine za gašenje.Zatvorite, neće proizvesti fluorescenciju.

Nakon što se generira PCR produkt, tijekom procesa žarenja, srednji dio molekularnog svjetionika uparuje se sa specifičnom sekvencom DNK, a fluorescentni gen se odvaja od gena za gašenje radi proizvodnje fluorescencije.

Glavni nedostaci druge generacije PCR-a:

Osjetljivost još uvijek nedostaje, a detekcija uzoraka niske kopije nije točna.

Postoji utjecaj pozadinske vrijednosti, a rezultat je osjetljiv na smetnje.

Treća generacija digitalnog PCR-a

Digitalni PCR (DigitalPCR, dPCR, Dig-PCR) izračunava broj kopija ciljne sekvence putem detekcije krajnje točke i može izvesti točnu apsolutnu kvantitativnu detekciju bez korištenja internih kontrola i standardnih krivulja.

Digitalni PCR koristi detekciju krajnje točke i ne ovisi o vrijednosti Ct (prag ciklusa), tako da je digitalna PCR reakcija manje pod utjecajem učinkovitosti pojačanja, a tolerancija na inhibitore PCR reakcije je poboljšana, uz visoku točnost i ponovljivost.

Zbog značajki visoke osjetljivosti i visoke točnosti, inhibitori PCR reakcije ne mogu ga lako ometati i može postići pravu apsolutnu kvantifikaciju bez standardnih proizvoda, što je postalo žarište istraživanja i primjene.

Prema različitim oblicima reakcijske jedinice, može se podijeliti u tri vrste: mikrofluidne, čip i kapljične sustave.