RNaza je osjetljiva riječ koju mnogi studenti koji često provode eksperimente ekstrakcije RNK ne žele čuti.Potpuno naoružana, RNA koja je konačno ekstrahirana s visoko toksičnim reagensima fenolom i kloroformom je razgrađena.Ne mirim se!!!Danas, pogledajmo podrijetlo slavne Rnase.

Ribonukleaza (RNase) ili RNaza je nukleaza koja može hidrolizirati RNK u male molekule.RNaza, kao protein male molekule, neobično je stabilna .Konvencionalna sterilizacija parom na visokim temperaturama i pod visokim pritiskom te inhibitori proteina ne mogu ga potpuno deaktivirati.Stabilnost RNaze uglavnom dolazi od disulfidnih veza u strukturi.Na primjer, uobičajeno korištena RNaza goveđeg pankreasa ima samo 124 aminokiseline, ali sadrži 4 disulfidne veze.Sumporna veza i disulfidna veza daju RNazi izvrsnu toplinsku stabilnost.Osim toga, rnaza ima relativno malu molekularnu težinu i može brzo vratiti svoju izvornu konformaciju u mnogim slučajevima.

Osim što je izuzetno stabilan,RNaze su sveprisutne u laboratoriju .RNaza je biološki obrambeni mehanizam.Za stanicu je egzogena RNA često kobna.U usporedbi s egzogenom DNK, egzogena RNK često je opasnija.RNA se sretno prepisuje i prevodi, tako da su gotovo svi organizmi razvili RNaze za obranu od invazije egzogene RNA.Stoga bakterijske stanice uzgojene u laboratoriju i vi koji izdvajate RNK odišu aromom RNaze.Ljudske tjelesne tekućine (slina, suze, itd.) sadrže veliku količinu RNaze, stoga nemojte plakati kada se RNK razgradi.Što više plačete, razgradnja RNK je gora!!Sestra Daiyu nije prikladna za ekstrakciju RNK!

Osim toga, vaša nježna koža također sadrži puno RNaze, a markeri, pipete, vrata hladnjaka i ručke koje je dodirnula koža također sadrže RNazu.

Uz toliko brbljanja, pogledajmo kako se nositi s RNazama.

Prva stvar na koju svatko pomisli kada uklanja RNK jeDEPC(dietil pirokarbonat).DEPC uglavnom denaturira protein spajanjem s imidazolnim prstenom histidina aktivne skupine RNaze, čime inhibira aktivnost enzima.0,1% DEPC može imati bolji učinak uklanjanja Rnase, ali moramo obratiti pozornost da je DEPC poznati kancerogen, pa treba obratiti posebnu pozornost pri njegovoj uporabi.

Za RNazu moramo krenuti od dva aspekta,prvi je inhibicija aktivnosti endogene RNaze

Konvencionalni reagensi za ekstrakciju RNK kao što su gvanidin izotiocijanat i DTT sadržani u Trizolu mogu otvoriti disulfidnu vezu RNaze, ali još uvijek postoje neke RNaze, posebno u uzorcima tkiva, stoga obratite pozornost na nisku temperaturu.

1.Odmah uronite uzorak tkiva u tekući dušik nakon što ga izvadite ili u komercijalnu otopinu za očuvanje RNA.

2.Nakon ekstrakcije RNK uzorka stanice, dodajte je u otopinu za lizu i lizirajte je na kutiji za led

3. Za mljevenje je najbolje koristiti tekući dušik kada se uzorci tkiva homogeniziraju.Kada koristite električni homogenizator bez tekućeg dušika, obratite pozornost na potpuno prethodno hlađenje adaptera za homogenat.

Druga je egzogena DNaza

1.Budite potpuno naoružani, nosite laboratorijsku kutu, nosite masku i obavezno nosite par novih rukavica (ne budite toliko štedljivi!! Treba napomenuti da je Trizol super korozivan, a također je vrlo jak kroz rukavice, stoga nemojte kapati na ruke).

2.Svi korišteni vrhovi pipeta, EP epruvete, PCR epruvete i druga oprema moraju se tretirati de-RNase.Može se natopiti u 0,1% DEPC i zatim pod visokim tlakom.Obratite pozornost na rad u napi.Lokalni tirani mogu izravno kupiti potrošni materijal za uklanjanje enzima.

PS: Reći ću vam jednu lijenu metodu.Iako visoka temperatura i visoki tlak ne mogu u potpunosti ukloniti RNazu, uklonit će veliki dio.2 puta visoka temperatura i visoki tlak imaju dobar učinak, a ekstrakcija RNA ima mali učinak.

3.Alkohol može denaturirati proteine,pa se stol za ekstrakciju RNK može prebrisati 75% alkoholom , a rukavice se mogu i poprskati alkoholom.

4.Konačnu otopinu za otapanje RNA i epruvetu za centrifugu također treba tretirati de-RNase.DEPC voda je često korištena otopina za otapanje RNK.Razgovarajmo o ispravnoj metodi pripreme DEPC vode (ne zaboravite prepakirati komercijalni DEPC kada ga kupujete)

Dodajte DEPC u ultračistu vodu u omjeru 1:1000, dobro protresite, ostavite stajati preko noći na 37°C i sterilizirajte na 121°C pod visokom temperaturom i visokim tlakom 15 minuta.DEPC voda se može čuvati na -20°C u alikvotima od 1 ml.

Na kraju, da rezimiramo: niska temperatura je ključ, potrošnim materijalom se dobro rukuje, potpuno naoružan i manje priče!

Eto, to je to za današnju strategiju.Želim vam svu RNK koncentraciju i čistoću koju ste spomenuli.Oba A260/A280 su 2.0!!!

Naravno, ako koristite arad na sobnoj temperaturi Komplet za ekstrakciju RNK, možda nećete naići na gore navedene probleme.

Rad na sobnoj temperaturi, bez dodavanja DNaze, ekstrahira ukupnu RNK iz stanica za 11 minuta, a ekstrahira ukupnu RNK iz životinjskih tkiva ili biljaka za 30 minuta.

Za probne uzorke obratite se:overseas@foregene.com

Povezani proizvodi:

https://www.foreivd.com/cell-total-rna-isolation-kit-product/

https://www.foreivd.com/animal-total-rna-isolation-kit-product/

https://www.foreivd.com/plant-total-rna/