Izravni PCR je reakcija koja izravno koristi životinjska ili biljna tkiva za umnožavanje bez ekstrakcije nukleinske kiseline.Na mnogo načina izravni PCR radi kao obični PCR

Glavna razlika je prilagođeni pufer koji se koristi u izravnoj PCR reakciji, uzorak se može izravno podvrgnuti PCR reakciji bez ekstrakcije nukleinske kiseline, ali postoje odgovarajući zahtjevi za toleranciju enzima i kompatibilnost pufera uključenog u izravnu PCR reakciju.

Iako u uobičajenim uzorcima postoji više ili manje inhibitora PCR-a, direktni PCR još uvijek može postići pouzdano umnožavanje pod djelovanjem enzima i pufera.Tradicionalna PCR reakcija zahtijeva visokokvalitetnu nukleinsku kiselinu kao predložak, koji može spriječiti glatko napredovanje PCR reakcije ako predložak sadrži proteine ​​i druge nečistoće.Direct PCR trenutno je jedna od popularnijih tehnologija u području molekularne dijagnostike.

01 Izravni PCR izvorno se koristio za životinje i biljke

Najranija primjena izravne PCR je u području životinja i biljaka, kao što su krv, tkivo i dlaka štakora, mačke, kokoši, zeca, ovce, goveda itd., listovi i sjemenke biljaka itd., koji se koriste za proučavanje genotipizacije, transgenetike, detekcije plazmida, analize izbacivanja gena, identifikacije izvora DNA, identifikacije vrsta, SNP analize i drugih polja.

Ova polja imaju neke zajedničke značajke, to jest, ciljni sadržaj gena je relativno visok i ekstrakcija nukleinske kiseline je problematična, tako da izravna PCR ne samo da može uštedjeti vrijeme i imati mali utjecaj na rezultate, već i smanjiti troškove.

Izravni PCR koji se koristi za otkrivanje patogena stvar je posljednjih godina, neki proizvođači PCR reagensa uložili su mnogo napora u tom smjeru kada su uveli inovacije.Posebno u ovoj epidemiji COVID-19, na tržištu su se pojavili mnogi takvi proizvodi za otkrivanje, kao što je SARS-CoV-2 Komplet za otkrivanje nukleinske kiseline (Multiplex PCR Fluorescent Probe Method) koji je istražio i razvio Foregene, koji koristi tehnologiju RT PCR u stvarnom vremenu (rRT-PCR) za kvalitativno otkrivanje nukleinskih kiselina SARS-CoV-2 u ljudskom nazofaringealu ili orophu. uzorci briseva arinksa.

Foregene je jedna od tvrtki koja koristi Direct PCR tehnologiju za detekciju normalnih ORF1ab, N, E ivarijanta loze nukleinske kiseline u ljudskim uzorcima nazofaringealnog ili orofaringealnog brisa kao što su SARS-CoV-2 B.1.1.7 loza (UK), B.1.351 loza (ZA), B.1.617 loza (IND) i P.1 loza (BR).

02  Reagensi potrebni za direktni PCR

Uzorak lizata

Uzorak lizata možete konfigurirati sami ili kupiti.Razlika u sastavu različitih marki lizata učinit će sposobnost lizira različitom, a tada će vrijeme lizira biti malo drugačije.Na primjer, za pripremu uzoraka životinjskog tkiva općenito se preporučuje 30 minuta ili liza preko noći, a otopina za lizu za viruse kreće se od 3-10 minuta.

PCR glavna mješavina

Preporuča se koristiti DNA polimerazu s vrućim startom kako bi se pojačala specifična amplifikacija i povećala sposobnost amplifikacije.Srž izravnog PCR-a je visoko tolerantna polimeraza.

Ukloniti ili inhibirati komponente u uzorku koje utječu na umnožavanje DNA

Nakon što se uzorak obradi lizatom, proteini, lipidi i drugi stanični ostaci će se osloboditi, te će tvari inhibirati PCR reakciju.Stoga izravni PCR zahtijeva dodavanje odgovarajućeg uklanjanja ili inhibitora kako bi se smanjio utjecaj ovih čimbenika.

03  Zbirka od pet točaka znanja izravnog PCR-a

Prvo, Direct PCR tehnologija je izravna PCR tehnologija za razne biološke uzorke.Pod ovim tehničkim uvjetima, nema potrebe za odvajanjem i ekstrahiranjem nukleinske kiseline, izravnim korištenjem uzorka tkiva kao objekta i dodavanjem početnica ciljnog gena za izvođenje PCR reakcije.

Drugo, Direct PCR tehnologija nije samo tradicionalna tehnologija amplifikacije DNA predloška, ​​već također uključuje PCR reverzne transkripcije RNA predloška.

Treće, Direct PCR tehnologija ne samo da izravno izvodi rutinske kvalitativne PCR reakcije na uzorcima tkiva, već uključuje i qPCR reakcije u stvarnom vremenu, što zahtijeva da reakcijski sustav ima snažnu sposobnost interferencije fluorescencije u pozadini i sposobnost gašenja endogene fluorescencije antagonističku sposobnost.

Četvrto, uzorci ciljani Direct PCR tehnologijom trebaju samo otpuštanje šablona nukleinskih kiselina, a ne uklanjaju proteine, polisaharide, ione soli itd. koji ometaju PCR reakciju.Što zahtijeva da polimeraza nukleinske kiseline i PCR mješavina u reakcijskom sustavu imaju izvrsnu otpornost i prilagodljivost kako bi se osigurala aktivnost enzima i točnost replikacije u složenim uvjetima.

Peto, uzorak tkiva na koji cilja Direct PCR tehnologija bez ikakvog tretmana obogaćivanja nukleinskom kiselinom i količina predloška je vrlo mala, što zahtijeva da reakcijski sustav ima izuzetno visoku osjetljivost i učinkovitost pojačanja.