Vjerujem da će se svatko uvijek susresti s ovakvim ili onakvim problemima kada radi PCR reakcije, ali većina njih se može svrstati u dva glavna problema:

Premalo pojačanje predloška gena (amplifikacija);
Previše neciljne amplifikacije gena.
Korištenje aditiva jedna je od uobičajenih strategija za rješavanje ovih problema.Obično uloga aditiva ima dva aspekta:
sekundarna strukturagena (sekundarna struktura);
Smanjite nespecifično pražnjenje.
Danas će vam urednik ukratko predstaviti uobičajene aditive u PCR reakcijama i njihove funkcije.
Aditivi koji smanjuju sekundarnu strukturu
sulfoksid(DMSO)
uzorci genas visokim sadržajem GC .Međutim, DMSO također uvelike smanjuje aktivnost Taq polimeraze.Stoga svatko mora uravnotežiti dostupnost predloška i aktivnost polimeraze.Urednik predlaže da možete isprobati različite koncentracije DSMO-a, primjerice od 2% do 10%, kako biste pronašli koncentraciju koja odgovara vašem eksperimentu.
Neionski deterdženti
Neionski deterdženti, kao što je 0,1-1% Triton X-100, Tween 20 ili NP-40, obično smanjuju sekundarnu strukturu DNK.Iako ovo može povećati amplificiranje uzorka gena, također će uzrokovati probleme nespecifičnog pojačanja.Dakle, ovi aditivi dobro funkcioniraju za PCR reakcije niskog prinosa bez krhotina, ali ne tako dobro za relativno nečiste PRC reakcije.Još jedna prednost neionskih deterdženata je smanjenje onečišćenja SDS-om.Obično tijekom procesa ekstrakcije DNA, SDS će se dovesti do koraka PCR, što uvelike inhibira aktivnost polimeraze.Stoga dodavanje 0,5% Tween-20 ili Tween-40 u reakciju može neutralizirati negativne učinke SDS-a.
Betain_
Betain može poboljšati umnožavanje DNK smanjenjem stvaranja sekundarne strukture i općenito je "misteriozni" dodatak komercijalnim PCR kompletima.Ako želite koristiti betain, trebate staviti betain ili betain monohidrat (Betaine ili Betaine mono-hydrate), ali ne i betain hidroklorid (Betaine HCl), podesiti na konačnu koncentraciju od 1-1,7M.Betain također može pomoći u poboljšanju specifičnosti jer eliminira ovisnost sastava parova baza o topljenju/denaturaciji DNA.
Aditivi za smanjenje nespecifičnog pražnjenja
Formamid
Formamid je često korišteni organski PCR aditiv.Može se kombinirati s velikim i manjim utorima u DNK, čime se smanjuje stabilnost dvostruke spirale glavne DNK i snižava temperatura taljenja DNK.Koncentracija formamida koja se koristi u PCR eksperimentima obično je 1%-5%.
Tetrametilamonijev klorid( TMAC)
Tetrametilamonijev klorid može povećati specifičnost hibridizacije (hibridizacijska specifičnost) i povećati temperaturu taljenja DNA.Prema tome, TMAC može ukloniti nespecifično primaranje i smanjiti pogrešno vezanje DNA i RNA.Ako koristitedegenerirani početniciu PCR reakciji, ne zaboravite dodati TMAC, koji se obično koristi u koncentraciji od 15-100 mM.
Ostali uobičajeni aditivi
Uz dvije gore navedene kategorije aditiva, postoji mnogo uobičajenih aditiva u PCR reakcijama, iako imaju različite funkcije, ali su također vrlo važni.
Magnezijev ion
Magnezijev ion nezamjenjiv je kofaktor (kofaktor) polimeraze, odnosno bez magnezijevog iona polimeraza je neaktivna.Međutim, previše iona magnezija također može utjecati na učinkovitost polimeraze.Koncentracija magnezijevih iona u svakoj PCR reakciji će varirati.Kelatni agensi (kao što je EDTA ili citrat), koncentracija dNTP-a i proteina utječu na koncentraciju magnezijevih iona.Dakle, ako imate problema s PCR eksperimentom, možete pokušati promijeniti različite koncentracije magnezijevih iona, na primjer, od 1,0 do 4,0 mM, s intervalom od 0,5–1 mM između.
Vrijedno je napomenuti da višestruki ciklusi smrzavanja i odmrzavanja mogu dovesti do raslojavanja koncentracije otopine magnezijevog klorida.Stoga ga prije svake upotrebe morate potpuno otopiti, a prije uporabe dobro promiješati.
Goveđi serum albumin(goveđi albumin, BSA)
U eksperimentima molekularne kemije, albumin iz goveđeg seruma je vrlo čest dodatak, posebno u probavi restrikcijskim enzimima i PCR eksperimentima.U PCR reakcijama, BSA pomaže u smanjenju kontaminanata kao što su fenolni spojevi.Također je rečeno da može smanjiti prianjanje reaktanata na stijenku epruvete.U PCR reakciji, obično koncentracija dodanog BSA može doseći 0,8 mg/ml.
 
Povezani proizvodi:
PCR heroj(s bojom)
PCR heroj