Autori: Wang Xiaoyan, Zhao Eryu

Jedinica: bolnica Jiaozhou, bolnica Dongfang pridružena Sveučilištu Tongji

Trenutačno je glavni tip uzorka za detekciju nukleinske kiseline respiratornog patogena bris grla.Postoje mnoge vrste uobičajeno korištenih otopina za očuvanje uzoraka, od kojih sve treba držati u hladnjaku ili zamrznuti za transport i skladištenje;Teško je kontrolirati cijeli proces niske temperature tijekom procesa prikupljanja i transporta, a teško je osigurati kontrolu kvalitete prije testiranja uzorka^[1-2].

RNaza (RNase) je endonukleaza koja hidrolizira RNK, uglavnom prekidajući fosfodiesterske veze između nukleotida.Molekula RNaze je vrlo stabilna, u strukturi postoje disulfidne veze, a za njezino djelovanje nije potrebna prisutnost dvovalentnih kationa, pa se RNaza teško denaturira, a lako se renaturira čak i nakon visoke temperature ili uporabe denaturanata.RNaze se dijele na endogene i egzogene.Endogene RNaze mogu se osloboditi u isto vrijeme kada se stanice razbiju.Stoga je uklanjanje uloge endogenih RNaza vrlo kritičan korak u procesu ekstrakcije RNK.Egzogene RNaze su široko rasprostranjene.RNaze postoje u zraku, ljudskoj koži, kosi i slini, što su važni razlozi za laku razgradnju RNA^[3].

Upit podataka

CANS-CL02-A009 „Primjena smjernica za akreditaciju kvalitete i kompetentnosti medicinskog laboratorija u području molekularne dijagnostike” u tehničkim zahtjevima predlaže formuliranje odgovarajućih standarda kvalitete vode u skladu s primjenom;Jednokratni hermetički zatvoreni spremnici:

RNaza/Klasifikacija

(1) RNaza A

Ribonukleaza A (RNase A), izvedena iz goveđeg pankreasa, je endoribonukleaza koja može specifično napasti 3' kraj pirimidinskih ostataka na RNK, režući citozin ili uracil formiran od strane susjednih nukleotida.Fosfodiesterska veza, konačni produkt reakcije je 3′ pirimidinski nukleotid i oligonukleotid s 3′ pirimidinskim nukleotidom na kraju.

(2) RNaza T1

Ribonukleaza T1 (RNase T1) je izvedena iz Aspergillus orjzae, specifično djeluje na 3'-terminalni fosfat gvanina, a mjesto cijepanja je između 3' fosfata gvanina i 5' hidroksila susjednih nukleotida.Konačni proizvod reakcije je 3'gvanilna kiselina i oligonukleotidni fragmenti s 3'gvanilnom kiselinom na kraju.

(3) RNaza H

Ribonukleaza H (RNase H) je prvi put otkrivena u tkivu telećeg timusa, a njen kodirajući gen je kloniran u Escherichiu coli.Može posebno razgraditi DNA: RNA lance u RNA hibridnim dupleksima, što rezultira oligonukleotidima i mononukleotidima s 3'-OH i 5'-monofosfatnim krajevima, ne može razgraditi jednolančane ili dvolančane DNA ili RNA.

RNaza

Funkcija i uporaba

Ribonukleaza može katalizirati razgradnju ribonukleinske kiseline (RNA) i može se sintetizirati umjetno.Ljekovita mast se koristi lokalno za liječenje trauma i bolova u zglobovima.Prema izvješćima, ribonukleaza može promijeniti metabolizam stanica domaćina, inhibirati sintezu virusa, inhibirati proliferaciju virusa influence in vitro i inhibirati stvaranje vakcinije i herpes virusa u pilećim embrijima.Klinička uporaba ribonukleaze dnevna intramuskularna injekcija od 180 mg, korisna za liječenje epidemijskog encefalitisa, ribonukleaza može katalizirati razgradnju ribonukleinske kiseline (RNA) i sada se može umjetno sintetizirati.Ljekovita mast se koristi lokalno za liječenje trauma i bolova u zglobovima.Prema izvješćima, ribonukleaza može promijeniti metabolizam stanica domaćina, inhibirati sintezu virusa, inhibirati proliferaciju virusa influence in vitro i inhibirati stvaranje vakcinije i herpes virusa u pilećim embrijima.Klinička primjena dnevne intramuskularne injekcije ribonukleaze od 180 mg korisna je za liječenje epidemijskog encefalitisa.

RNaza

Definicija inhibitora

Definicija jedinice inhibitora RNaze: Količina enzima potrebna za inhibiciju 50% aktivnosti 5ng RNaze A je jedna jedinica.

Kako djeluju inhibitori RNaze

Gvanidin izotiocijanat:

Gvanidin izotiocijanat je organski spoj molekulske formule C2H6N4S.Uglavnom se koristi u biološkoj medicini, kemijskim reagensima itd. Gvanidin izotiocijanat je sredstvo za liziranje proteina i često se koristi kao glavna komponenta otopine za liziranje u molekularnim dijagnostičkim reagensima.Može lizirati tkivo, uništiti staničnu strukturu i odvojiti nukleinsku kiselinu od nukleoproteina, te ima jaku denaturaciju u RNazu.To je trenutno najučinkovitiji inhibitor RNaze.

TRIzol je novi reagens za ekstrakciju ukupne RNK koji može izravno ekstrahirati ukupnu RNK iz stanica ili tkiva.Sadrži tvari kao što su fenol i gvanidin izotiocijanat, koji mogu brzo poremetiti stanice i inhibirati nukleaze koje stanice oslobađaju.

(Međutim, gvanidin izotiocijanat je opasan za zdravlje laboratorijskih istraživača.)

RNasin:

Kiseli glikoprotein ekstrahiran iz štakorske jetre ili ljudskog blastoderma.Rnazin je nekompetitivni inhibitor RNaze, koji se može vezati za različite RNaze i inaktivirati ih.

(Više detalja: https://www.foreivd.com/foreasy-rnase-inhibitor-product/)

Hvisoka temperatura:

Visoka temperatura također je uobičajeno sredstvo denaturacije proteina.

Dietilpirokarbonat (DEPC):

DEPC je jak, ali nepotpun inhibitor RNaze, koji može inhibirati aktivnost RNaze kombiniranjem s imidazolnim prstenom aminokiseline aktivne skupine RNaze za denaturaciju proteina.

Vanadil ribonukleozidni kompleks:

Kompleks sastavljen od iona vanadijevog oksida i nukleozida, koji se veže na RNazu u obliku prijelaznih tvari, koje mogu gotovo potpuno inhibirati aktivnost RNaze

drugo:

SDS, urea, dijatomejska zemlja i dr. također imaju određeni inhibitorni učinak na RNazu.

Recenzije stručnjaka

Li Yujie glavni tehničar

Direktor laboratorijskog odjela, bolnica Jiaozhou, bolnica Dongfang pridružena Sveučilištu Tongji

Kako bi se spriječila biorazgradnja egzogene RNAze, maske, rukavice i kape treba nositi i često mijenjati tijekom procesa ekstrakcije RNA.Sve staklene posude moraju se peći u sušionici na 200°C više od 2 sata.Materijale koji se koriste za pečenje, poput plastike, potrebno je tretirati DEPC vodom, a zatim oprati destiliranom vodom.Reagensi ili uređaji koji se koriste za ekstrakciju, očuvanje i identifikaciju RNA trebali bi biti posvećeni RNA, a potrebno je postaviti neovisno područje rada RNA.

reference:

[1] Smith-Vaughan HC, Binks MJ, Beissbarth J, et al.Bakterije i virusi u nazofarinksu neposredno prije pojave akutnih infekcija donjeg dišnog sustava u australske domorodačke djece[J].Eur J Clin Microbiol Infect Dis, 2018, 37 (9): 1785-1794.

[2] Ogranak za kontrolu bolničkih infekcija Kineske udruge za preventivnu medicinu.Smjernice za prikupljanje i pregled kliničkih mikrobnih uzoraka [J].Kineski časopis o bolničkim infekcijama, 2018 (20): 3192-3200.

[3] “Klinički test Deset tisuća zašto Molecular Biology Test Volume”