• PCR je metoda koja se koristi za umnožavanje DNK iz male količine uzorka DNK.RT-PCR koristi obrnutu transkripciju za proizvodnju DNK predloška iz izvora RNK koji se zatim može pojačati.
• PCR i RT-PCR tipično su krajnje reakcije, dok qPCR i RT-qPCR koriste kinetiku brzine sinteze proizvoda tijekom PCR reakcije za kvantificiranje količine prisutnog predloška.
• Novije metode, kao što je digitalni PCR, daju apsolutnu kvantifikaciju početnog uzorka DNK, dok metode kao što je izotermalni PCR smanjuju potrebu za skupom opremom za dobivanje pouzdanih rezultata.

Lančana reakcija polimerazom (PCR) relativno je jednostavna i naširoko korištena tehnika molekularne biologije za pojačavanje i otkrivanje sekvenci DNA i RNA.U usporedbi s tradicionalnim metodama kloniranja i umnožavanja DNA, koje često mogu potrajati danima, za PCR je potrebno samo nekoliko sati.PCR je vrlo osjetljiv i zahtijeva minimalan predložak za detekciju i umnožavanje specifičnih sekvenci.Osnovne PCR metode dalje su napredovale od jednostavne detekcije DNA i RNA.U nastavku smo dali pregled različitih PCR metoda i reagensa koje nudimo u Enzo Life Sciences za vaše potrebe istraživanja.Cilj nam je pomoći znanstvenicima da brzo dođu do PCR reagensa za korištenje u svom sljedećem istraživačkom projektu!

PCR

Za standardni PCR, sve što trebate je DNK polimeraza, magnezij, nukleotidi, početnice, DNK šablon koji treba umnožiti i termocikler.Mehanizam PCR-a jednostavan je kao i njegova svrha: 1) dvolančana DNA (dsDNA) toplinski se denaturira, 2) početnice se poravnavaju s pojedinačnim lancima DNA i 3) početnice se produljuju pomoću DNA polimeraze, što rezultira u dvije kopije originalni lanac DNK.Proces denaturacije, žarenja i elongacije tijekom niza temperatura i vremena poznat je kao jedan ciklus pojačanja (slika 1).

Svaki korak ciklusa trebao bi biti optimiziran za korišteni predložak i temeljni set.Ovaj ciklus se ponavlja približno 20-40 puta, a pojačani produkt se zatim može analizirati, obično pomoću agaroznog gela (slika 2).

Kako je PCR vrlo osjetljiva metoda i za pojedinačne reakcije potrebne su vrlo male količine, preporučuje se priprema glavne mješavine za nekoliko reakcija.Glavna mješavina mora biti dobro izmiješana i zatim podijeljena prema broju reakcija, osiguravajući da će svaka reakcija sadržavati istu količinu enzima, dNTP-a i početnica.Mnogi dobavljači, poput Enzo Life Sciences, također nude PCR mješavine koje već sadrže sve osim početnica i DNK šablona.

Regije bogate gvaninom/citozinom (GC-bogate) predstavljaju izazov u standardnim PCR tehnikama.GC bogate sekvence su stabilnije od sekvenci s nižim GC sadržajem.Nadalje, sekvence bogate GC-om imaju tendenciju formiranja sekundarnih struktura, kao što su ukosnice.Kao rezultat toga, dvostruke niti bogate GC teško je potpuno odvojiti tijekom faze denaturacije.Posljedično, DNA polimeraza ne može nesmetano sintetizirati novi lanac.Viša temperatura denaturacije to može poboljšati, a prilagodbe prema višoj temperaturi žarenja i kraćem vremenu žarenja mogu spriječiti nespecifično vezanje primera bogatih GC.Dodatni reagensi mogu poboljšati pojačanje sekvenci bogatih GC-om.DMSO, glicerol i betain pomažu poremetiti sekundarne strukture koje su uzrokovane GC interakcijama i time olakšavaju odvajanje dvostrukih niti.

Hot Start PCR

Nespecifična amplifikacija je problem koji se može pojaviti tijekom PCR-a.Većina DNA polimeraza koje se koriste za PCR najbolje rade na temperaturama od oko 68°C do 72°C.Međutim, enzim može biti aktivan i na nižim temperaturama, iako u nižem stupnju.Na temperaturama daleko ispod temperature žarenja, primeri se mogu vezati nespecifično i dovesti do nespecifičnog pojačanja, čak i ako se reakcija odvija na ledu.To se može spriječiti upotrebom inhibitora polimeraze koji se odvajaju od DNA polimeraze tek kada se postigne određena temperatura, otuda i izraz "hot start PCR".Inhibitor može biti protutijelo koje veže polimerazu i denaturira na početnoj temperaturi denaturacije (obično 95°C).

Polimeraza visoke vjernosti

Iako se DNA polimeraze prilično točno umnožavaju na izvornu sekvencu predloška, ​​može doći do pogrešaka u podudaranju nukleotida.Nepodudarnosti u primjenama kao što je kloniranje mogu rezultirati skraćenim transkriptima i pogrešno prevedenim ili neaktivnim proteinima nizvodno.Kako bi se izbjegla ova nepodudaranja, identificirane su polimeraze s aktivnošću "lektoriranja" i uključene u tijek rada.Prva polimeraza za korekturu, Pfu, identificirana je 1991. u Pyrococcus furiosus.Ovaj Pfu enzim ima 3' do 5' egzonukleaznu aktivnost.Kako se DNA umnožava, egzonukleaza uklanja nepodudarne nukleotide na 3' kraju lanca.Ispravan nukleotid se zatim zamijeni i sinteza DNK se nastavlja.Identifikacija netočnih nukleotidnih sekvenci temelji se na afinitetu vezanja za točan nukleozid trifosfat s enzimom, pri čemu neučinkovito vezanje usporava sintezu i omogućuje ispravnu zamjenu.Lektorska aktivnost Pfu polimeraze rezultira s manje pogrešaka u konačnoj sekvenci u usporedbi s Taq DNA polimerazom.Posljednjih godina identificirani su drugi enzimi za korekturu, a napravljene su modifikacije izvornog enzima Pfu kako bi se dodatno smanjila stopa pogreške tijekom amplifikacije DNA.

RT-PCR

PCR s obrnutom transkripcijom, ili RT-PCR, omogućuje korištenje RNA kao uzorka.Dodatni korak omogućuje otkrivanje i umnožavanje RNA.RNA se obrnuto prepisuje u komplementarnu DNA (cDNA), pomoću reverzne transkriptaze.Kvaliteta i čistoća RNA uzorka ključni su za uspjeh RT-PCR.Prvi korak RT-PCR je sinteza DNA/RNA hibrida.Reverzna transkriptaza također ima funkciju RNaze H, koja razgrađuje RNA dio hibrida.Molekula jednolančane DNA se zatim dovršava pomoću DNA-ovisne DNA polimerazne aktivnosti reverzne transkriptaze u cDNA.Učinkovitost reakcije prvog lanca može utjecati na proces amplifikacije.Od sada se standardna PCR procedura koristi za umnožavanje cDNA.Mogućnost pretvorbe RNA u cDNA pomoću RT-PCR ima mnoge prednosti, a prvenstveno se koristi za analizu ekspresije gena.RNA je jednolančana i vrlo nestabilna, što čini rad s njom izazovnim.Obično služi kao prvi korak u qPCR-u, koji kvantificira transkripte RNK u biološkom uzorku.

qPCR i RT-qPCR

Kvantitativni PCR (qPCR) koristi se za otkrivanje, karakterizaciju i kvantificiranje nukleinskih kiselina za brojne primjene.U RT-qPCR-u, RNA transkripti se često kvantificiraju tako da se najprije obrnuto prepisuju u cDNA, kao što je gore opisano, a zatim se naknadno provodi qPCR.Kao u standardnoj PCR, DNA se umnožava u tri koraka koji se ponavljaju: denaturacija, žarenje i elongacija.Međutim, u qPCR-u fluorescentno označavanje omogućuje prikupljanje podataka kako PCR napreduje.Ova tehnika ima mnoge prednosti zbog niza dostupnih metoda i kemikalija.

U qPCR-u koji se temelji na boji (obično zeleno), fluorescentno označavanje omogućuje kvantifikaciju umnoženih molekula DNK korištenjem boje za vezanje dsDNA.Tijekom svakog ciklusa mjeri se fluorescencija.Signal fluorescencije raste proporcionalno količini replicirane DNA.Stoga se DNK kvantificira u "stvarnom vremenu" (slika 3).Nedostaci qPCR-a temeljenog na bojilu su da se može ispitati samo jedna meta u isto vrijeme i da će se boja vezati na bilo koji ds-DNA prisutan u uzorku.

U qPCR-u temeljenom na sondi, mnogi se ciljevi mogu detektirati istovremeno u svakom uzorku, ali to zahtijeva optimizaciju i dizajn probe specifične za metu koja se koristi uz početnice.Dostupno je nekoliko tipova dizajna sondi, ali najčešći tip je sonda za hidrolizu, koja uključuje fluorofor i prigušivač.Prijenos energije fluorescentne rezonancije (FRET) sprječava emisiju fluorofora kroz prigušivač dok je sonda netaknuta.Međutim, tijekom PCR reakcije, sonda se hidrolizira tijekom ekstenzije početnice i pojačanja specifične sekvence na koju je vezana.Cijepanje sonde odvaja fluorofor od gasitelja i rezultira povećanjem fluorescencije ovisno o pojačanju (slika 4).Stoga je signal fluorescencije iz qPCR reakcije temeljene na sondi proporcionalan količini ciljne sekvence sonde prisutne u uzorku.Budući da je qPCR temeljen na sondi specifičniji od qPCR-a temeljenog na boji, to je često tehnologija koja se koristi u dijagnostičkim testovima temeljenim na qPCR-u.

Izotermno pojačanje

Gore navedene tehnike PCR-a zahtijevaju skupu opremu za termocikliranje za precizno povećanje i smanjenje temperature komore za korake denaturacije, žarenja i produljenja.Razvijen je niz tehnika koje ne zahtijevaju tako precizne uređaje i mogu se izvoditi u jednostavnoj vodenoj kupelji ili čak unutar stanica od interesa.Ove tehnike zajednički se nazivaju izotermno pojačanje i rade na temelju eksponencijalnog, linearnog ili kaskadnog pojačanja.

Najpoznatija vrsta izotermalnog pojačanja je izotermno pojačanje posredovano petljom ili LAMP.LAMP koristi eksponencijalno pojačanje na 65⁰C za pojačavanje predloške DNA ili RNA.Prilikom izvođenja LAMP-a, četiri do šest početnica komplementarnih regijama ciljne DNA koriste se s DNA polimerazom za sintetiziranje nove DNA.Dvije od ovih početnica imaju komplementarne sekvence koje prepoznaju sekvence u drugim početnicama i vežu ih, dopuštajući stvaranje strukture "petlje" u novosintetiziranoj DNK koja zatim pomaže žarenju početnica u sljedećim krugovima amplifikacije.LAMP se može vizualizirati višestrukim metodama, uključujući fluorescenciju, elektroforezu u agaroznom gelu ili kolorimetriju.Lakoća vizualizacije i otkrivanja prisutnosti ili odsutnosti proizvoda kolorimetrijom i nedostatak potrebne skupe opreme učinili su LAMP prikladnom opcijom za testiranje na SARS-CoV-2 u područjima gdje kliničko laboratorijsko testiranje nije bilo lako dostupno ili skladištenje i transport uzoraka nije bilo izvedivo, ili u laboratorijima koji prethodno nisu imali opremu za PCR termocikliranje.