1. Osnovno znanje (ako želite vidjeti eksperimentalni dio, prijeđite izravno na drugi dio)
Kao derivat konvencionalne PCR reakcije, PCR u stvarnom vremenu uglavnom prati promjenu količine produkta amplifikacije u svakom ciklusu reakcije PCR amplifikacije u stvarnom vremenu kroz promjenu signala fluorescencije i kvantitativno analizira početni obrazac kroz odnos između ct vrijednosti i standardne krivulje.
Specifični podaci RT-PCR suOsnovna linija, prag fluorescencijeiCt vrijednost.
| Osnovna linija: | Vrijednost fluorescencije 3.-15. ciklusa je osnovna (baseline), koja je uzrokovana povremenom greškom mjerenja. |
| Prag (prag): | Odnosi se na granicu detekcije fluorescencije postavljenu na odgovarajuću poziciju u području eksponencijalnog rasta krivulje pojačanja, općenito 10 puta standardne devijacije od osnovne linije. |
| CT vrijednost: | To je broj PCR ciklusa kada vrijednost fluorescencije u svakoj reakcijskoj epruveti dosegne prag. Vrijednost Ct obrnuto je proporcionalna količini početnog predloška. |
Uobičajene metode označavanja za RT-PCR:
| metoda | prednost | nedostatak | opseg primjene |
| SYBR ZelenaⅠ | Široke primjenjivosti, osjetljiv, jeftin i praktičan | Zahtjevi za temeljne premaze su visoki, skloni nespecifičnim trakama | Pogodan je za kvantitativnu analizu različitih ciljnih gena, istraživanje ekspresije gena i istraživanje transgenih rekombinantnih životinja i biljaka. |
| TaqMan | Dobra specifičnost i visoka ponovljivost | Cijena je visoka i prikladna samo za specifične ciljeve. | Detekcija patogena, istraživanje gena rezistencije na lijekove, procjena učinkovitosti lijekova, dijagnostika genetskih bolesti. |
| molekularni svjetionik | Visoka specifičnost, fluorescencija, niska pozadina | Cijena je visoka, prikladan je samo za određenu namjenu, dizajn je težak, a cijena je visoka. | Specifična genska analiza, SNP analiza |
2. Eksperimentalni koraci
2.1 O eksperimentalnom grupiranju- mora postojati više jažica u skupini i moraju postojati biološka ponavljanja.
| ① | Prazna kontrola | Koristi se za otkrivanje stanja rasta stanica u eksperimentima |
| ② | Negativna kontrola siRNA (nespecifična siRNA sekvenca) | Pokazati specifičnost djelovanja RNAi.siRNA može inducirati nespecifični odgovor na stres pri koncentraciji od 200 nM. |
| ③ | Kontrola reagensa za transfekciju | Isključite toksičnost transfekcijskog reagensa za stanice ili učinak na ekspresiju ciljnog gena |
| ④ | siRNA protiv ciljnog gena | Smanjite ekspresiju ciljnog gena |
| ⑤ (nije obavezno) | pozitivna siRNA | Koristi se za rješavanje problema eksperimentalnog sustava i operativnih problema |
| ⑥ (neobavezno) | Fluorescentna kontrola siRNA | Učinkovitost transfekcije stanica može se promatrati mikroskopom |
2.2 Načela dizajna temeljnih premaza
| Povećana veličina fragmenta | Poželjno na 100-150 bp |
| Primer Duljina | 18-25bp |
| GC sadržaj | 30%-70%, poželjno 45%-55% |
| Tm vrijednost | 58-60 ℃ |
| Slijed | Izbjegavajte kontinuirani T/C;A/G kontinuirano |
| 3 završna sekvenca | Izbjegavajte GC rich ili AT rich;terminalna baza je poželjno G ili C;najbolje je izbjegavati T |
| Komplementarnost | Izbjegavajte komplementarne sekvence s više od 3 baze unutar početnice ili između dvije početnice |
| Specifičnost | Upotrijebite blast search kako biste potvrdili specifičnost primera |
①SiRNA je specifična za vrstu, a sekvence različitih vrsta bit će različite.
②SiRNA je pakirana u liofilizirani prah, koji se može stabilno čuvati 2-4 tjedna na sobnoj temperaturi.
2.3 Alati ili reagensi koje je potrebno pripremiti unaprijed
| Primer (interna referenca) | Uključujući dva naprijed i natrag |
| Primeri (ciljni gen) | Uključujući dva naprijed i natrag |
| Ciljna Si RNA (3 trake) | Općenito, tvrtka će sintetizirati 3 trake, a zatim odabrati jednu od tri pomoću RT-PCR |
| Komplet za transfekciju | Lipo2000 itd. |
| Kit za brzu ekstrakciju RNK | Za ekstrakciju RNA nakon transfekcije |
| Komplet za brzu obrnutu transkripciju | za sintezu cDNA |
| Komplet za PCR pojačanje | 2×Super SYBR Green qPCR glavna mješavina |
2.4 Što se tiče problema na koje treba obratiti pozornost u određenim eksperimentalnim koracima:
①proces transfekcije siRNA
1. Za ploču možete odabrati ploču s 24 jažice, ploču s 12 jažica ili ploču sa 6 jažica (prosječna predložena koncentracija RNA u svakoj jažici ploče s 24 jažice je oko 100-300 ng/uL), a optimalna gustoća transfekcije stanica je do 60 %-80 % ili tako
2. Koraci transfekcije i specifični zahtjevi su strogo u skladu s uputama.
3. Nakon transfekcije, uzorci se mogu prikupiti unutar 24-72 sata za detekciju mRNA (RT-PCR) ili detekciju proteina unutar 48-96 sati (WB)
② Proces ekstrakcije RNK
1. Spriječiti kontaminaciju egzogenim enzimima.To uglavnom uključuje strogo nošenje maski i rukavica;korištenje steriliziranih vrhova pipeta i EP cijevi;voda korištena u eksperimentu mora biti bez RNaze.
2. Preporuča se učiniti dva puta kako je predloženo u kompletu za brzo vađenje, što će stvarno poboljšati čistoću i prinos.
3. Otpadna tekućina ne smije dodirivati kolonu RNA.
③ Kvantifikacija RNA
Nakon što se RNA ekstrahira, može se kvantificirati izravno s Nanodropom, a minimalno očitanje može biti samo 10 ng/ul.
④Postupak obrnute transkripcije
1. Zbog visoke osjetljivosti RT-qPCR-a, potrebno je napraviti najmanje 3 paralelne jažice za svaki uzorak kako bi se spriječilo da kasniji Ct bude previše različit ili da SD bude prevelik za statističku analizu.
2. Nemojte više puta zamrzavati i odmrzavati Master mix.
3. Svaka cijev/rupa mora se zamijeniti novim vrhom!Nemojte stalno koristiti isti vrh pipete za dodavanje uzoraka!
4. Film pričvršćen na ploču s 96 jažica nakon dodavanja uzorka potrebno je zagladiti pločicom.Najbolje je centrifugirati prije stavljanja na stroj, tako da tekućina sa stijenke cijevi može otjecati prema dolje i ukloniti mjehuriće zraka.
⑤ Analiza zajedničke krivulje
| Nema perioda logaritamskog rasta | Moguća visoka koncentracija predloška |
| Nema CT vrijednosti | Neispravni koraci za otkrivanje fluorescentnih signala; degradacija primera ili sondi – njegov se integritet može otkriti PAGE elektroforezom; nedovoljna količina predloška; degradacija šablona – izbjegavanje unošenja nečistoća i ponovnog smrzavanja i odmrzavanja u pripremi uzorka; |
| Ct>38 | Niska učinkovitost pojačanja;PCR proizvod je predug;razne komponente reakcije se razgrađuju |
| Linearna krivulja pojačanja | Sonde se mogu djelomično razgraditi ponovljenim ciklusima smrzavanja i odmrzavanja ili produljenim izlaganjem svjetlu |
| Razlika u duplim rupama je posebno velika | Reakcijska otopina nije potpuno otopljena ili reakcijska otopina nije pomiješana;termalna kupka PCR instrumenta je kontaminirana fluorescentnim tvarima |
2.5 O analizi podataka
Analiza podataka qPCR-a može se podijeliti na relativnu kvantifikaciju i apsolutnu kvantifikaciju.Na primjer, stanice u liječenoj skupini u usporedbi sa stanicama u kontrolnoj skupini,
Koliko se puta mRNA gena X promijeni, to je relativna kvantifikacija;u određenom broju stanica mRNA X gena
Koliko ima kopija, ovo je apsolutna kvantifikacija.Obično ono što najviše koristimo u laboratoriju je relativna kvantitativna metoda.Obično,metoda 2-ΔΔctkoristi se najviše u eksperimentima, pa će ovdje biti detaljno predstavljena samo ova metoda.
2-ΔΔct metoda: Dobiveni rezultat je razlika u ekspresiji ciljnog gena u eksperimentalnoj skupini u odnosu na ciljni gen u kontrolnoj skupini.Zahtijeva se da učinkovitost pojačanja i ciljnog gena i internog referentnog gena bude blizu 100%, a relativno odstupanje ne smije prelaziti 5%.
Metoda izračuna je sljedeća:
Δct kontrolna skupina = ct vrijednost ciljnog gena u kontrolnoj skupini – ct vrijednost internog referentnog gena u kontrolnoj skupini
Δct eksperimentalna skupina = ct vrijednost ciljnog gena u eksperimentalnoj skupini – ct vrijednost internog referentnog gena u eksperimentalnoj skupini
ΔΔct=Δct eksperimentalna skupina-Δct kontrolna skupina
Na kraju, izračunajte umnožak razlike u razini izražavanja:
Change Fold=2-ΔΔct (odgovara excel funkciji je POWER)
Povezani proizvodi:
Vrijeme objave: 20. svibnja 2023
