• facebook
  • linkedin
  • youtube

Polazni materijal: RNA

Kvantitativna reverzna transkripcija PCR (RT-qPCR) je eksperimentalna metoda koja se koristi u PCR pokusima koji koriste RNA kao početni materijal.U ovoj metodi, ukupna RNA ili glasnička RNA (mRNA) prvo se prepisuje u komplementarnu DNA (cDNA) pomoću reverzne transkriptaze.Zatim je izvedena qPCR reakcija korištenjem cDNA kao uzorka.RT-qPCR korišten je u raznim primjenama molekularne biologije, uključujući analizu ekspresije gena, validaciju interferencije RNK, validaciju mikromreža, otkrivanje patogena, genetsko testiranje i istraživanje bolesti.

Metode u jednom i dva koraka za RT-qPCR

RT-qPCR se može postići metodom u jednom ili dva koraka.RT-qPCR u jednom koraku kombinira reverznu transkripciju i PCR amplifikaciju, omogućujući reverznoj transkriptazi i DNA polimerazi da završe reakciju u istoj epruveti pod istim puferskim uvjetima.RT-qPCR u jednom koraku zahtijeva samo upotrebu početnica specifičnih za sekvencu.U RT-qPCR-u u dva koraka, reverzna transkripcija i PCR amplifikacija izvode se u dvije epruvete, koristeći različite optimizirane pufere, reakcijske uvjete i strategije dizajna početnica.

članak1

 

Prednost

Hendikep

Jedan korak Ova metoda ima manju eksperimentalnu pogrešku jer se obje reakcije izvode u jednoj epruveti

 

Manje koraka pipetiranja smanjuje rizik od kontaminacije

 

Prikladno za visokopropusno pojačanje/pregled, brzo i ponovljivo

Reakcije u dva koraka ne mogu se zasebno optimizirati

 

Budući da su uvjeti reakcije ugroženi kombinacijom reakcije u dva koraka, osjetljivost nije tako dobra kao kod metode u dva koraka

 

Broj meta otkrivenih jednim uzorkom je mali

Dva koraka Sposobnost stvaranja stabilnih knjižnica cDNA koje se mogu pohraniti dulje vrijeme i koristiti u više reakcija

 

Ciljni geni i referentni geni mogu se umnožiti iz iste cDNA biblioteke bez potrebe za višestrukim cDNA bibliotekama

 

Reakcijski puferi i reakcijski uvjeti koji omogućuju optimizaciju pojedinačnih reakcija

 

Fleksibilan odabir uvjeta okidača

Korištenje više epruveta i više koraka pipetiranja povećava rizik od kontaminacije DNK,

i dugotrajan.

 

Zahtijeva više optimizacije od metode u jednom koraku

Povezani proizvodi:

RT-qPCR Easyᵀᴹ (One Step)-SYBR Green I

RT-qPCR Easyᵀᴹ (Jedan korak)-Taqman

RT Easyᵀᴹ I Glavni premiks za sintezu prvog lanca CDNA

Real Time PCR Easyᵀᴹ-SYBR Green I Kit

PCR u stvarnom vremenu Easyᵀᴹ-Taqman

Odabir ukupne RNA i mRNA

Prilikom dizajniranja RT-qPCR eksperimenta, važno je odlučiti hoćete li koristiti ukupnu RNA ili pročišćenu mRNA kao predložak za obrnutu transkripciju.Iako mRNA može pružiti nešto veću osjetljivost, ukupna RNA još uvijek se često koristi.Razlog tome je što ukupna RNA ima važniju prednost kao početni materijal od mRNA.Prvo, proces zahtijeva manje koraka pročišćavanja, što osigurava bolji kvantitativni oporavak predloška i bolju normalizaciju rezultata na početni broj stanica.Drugo, izbjegava korak obogaćivanja mRNA, čime se može izbjeći mogućnost iskrivljenih rezultata zbog različitih oporavka različitih mRNA.Općenito, budući da je u većini primjena relativna kvantifikacija ciljnog gena važnija od apsolutne osjetljivosti detekcije, ukupna RNA je prikladnija u većini slučajeva.

Primer obrnute transkripcije

U metodi u dva koraka, tri različite metode mogu se koristiti za početak cDNA reakcije: oligo(dT) početnice, nasumične početnice ili sekvencija specifične početnice.Tipično, oligo(dT) primeri i nasumični primeri se koriste u kombinaciji.Ovi primeri spajaju se s matičnim lancem mRNA i daju reverznoj transkriptazi početnu točku za sintezu.

članak2

Izbor temeljnog premaza Građa i funkcija Prednost Hendikep
Oligo(dT) primer (ili usidreni oligo(dT) primer) Produženo žarenje na timinske ostatke na poli(A) repu mRNA;sidreni oligo(dT) primer sadrži G, C ili A na 3' kraju (mjesto sidrenja) Sinteza cDNA pune duljine iz mRNA s poli(A)-repom

 

Primjenjivo kada je dostupno manje početnog materijala

 

Mjesto sidrenja osigurava da se oligo(dT) primer veže na 5' poli(A) rep mRNA

Prikladno samo za pojačavanje gena s poli(A) repovima

 

Nabavite cDNA skraćenu s početnog mjesta*2 u poli(A)

 

Nagnut za vezanje na 3′ kraj*

 

*Ova je mogućnost svedena na minimum ako se koriste usidreni oligo(dT) primeri

slučajni primer

 

6 do 9 baza u duljinu, koje se mogu spojiti na više mjesta tijekom transkripcije RNA Spajanje na sve RNA (tRNA, rRNA i mRNA)

 

Prikladno za transkripte sa značajnom sekundarnom strukturom ili kada je dostupno manje početnog materijala

 

Visoki prinos cDNA

cDNA se reverzno prepisuje sa svih RNA, što obično nije poželjno i može razrijediti signal ciljne mRNA

 

dobiti skraćenu cDNA

početnice specifične za sekvencu Prilagođeni primeri koji ciljaju specifične sekvence mRNA specifična biblioteka cDNA

 

Poboljšajte osjetljivost

 

Korištenje reverznih qPCR početnica

Ograničeno samo na sintezu jednog ciljanog gena

Reverzna transkriptaza

Reverzna transkriptaza je enzim koji koristi RNA za sintezu DNA.Neke reverzne transkriptaze imaju aktivnost RNAze i mogu degradirati RNA lance u RNA-DNA hibridnim lancima nakon transkripcije.Ako nema enzimatsku aktivnost RNaze, može se dodati RNazaH za veću učinkovitost qPCR.Često korišteni enzimi uključuju Moloney reverznu transkriptazu virusa mišje leukemije i reverznu transkriptazu virusa ptičjeg mijeloblastoma.Za RT-qPCR idealno je odabrati reverznu transkriptazu s većom termostabilnošću, tako da se sinteza cDNA može izvesti na višim temperaturama, osiguravajući uspješnu transkripciju RNA s višom sekundarnom strukturom, uz zadržavanje njihove pune aktivnosti tijekom reakcije, što rezultira višim prinosima cDNA.

Povezani proizvodi:

Foreasy M-MLV reverzna transkriptaza

RNaza H aktivnost reverzne transkriptaze

RNaseH može razgraditi RNA lance iz RNA-DNA dupleksa, omogućujući učinkovitu sintezu dvolančane DNA.Međutim, kada se kao predložak koristi duga mRNA, RNA se može prerano razgraditi, što rezultira skraćenom cDNA.Stoga je često korisno minimizirati aktivnost RNaseH tijekom cDNA kloniranja ako se želi sinteza dugih transkripata.Nasuprot tome, reverzne transkriptaze s aktivnošću RNaze H često su korisne za primjene qPCR-a jer pospješuju topljenje dupleksa RNA-DNA tijekom prvog ciklusa PCR-a.

Dizajn temeljnog premaza

PCR početnice koje se koriste za korak qPCR-a u RT-qPCR-u idealno bi trebale biti dizajnirane tako da obuhvaćaju spoj ekson-egzon, gdje bi početnica za pojačanje potencijalno mogla obuhvatiti stvarnu granicu egzon-intron.Budući da sekvence genomske DNA koje sadrže intron nisu umnožene, ovaj dizajn smanjuje rizik od lažno pozitivnih umnožavanja zbog kontaminacije genomske DNA.

Ako se početnice ne mogu dizajnirati za odvajanje egzona ili granica egzon-egzon, možda će biti potrebno tretirati uzorke RNA s DNazom I bez RNaze ili dsDNazom kako bi se uklonila kontaminacija genomske DNK.

RT-qPCR kontrola

Negativna kontrola reverzne transkripcije (-RT kontrola) trebala bi biti uključena u sve RT-qPCR pokuse za otkrivanje kontaminacije DNK (kao što je genomska DNK ili PCR proizvodi iz prethodnih reakcija).Ova kontrola sadrži sve komponente reakcije osim reverzne transkriptaze.Budući da s ovom kontrolom ne dolazi do reverzne transkripcije, ako se primijeti PCR amplifikacija, najvjerojatnija je kontaminacija iz DNA.


Vrijeme objave: 2. kolovoza 2022