• facebook
  • linkedin
  • youtube

Tradicionalne reverzne transkriptaze ne podnose visoke temperature (optimalna temperatura za aktivnost MMLV je 37-50°C, a AMV je 42-60°C).Složenija virusna RNA ne može se učinkovito prepisati u cDNA na niskim temperaturama, što rezultira smanjenjem učinkovitosti detekcije.Tradicionalni RT-qPCR općenito zahtijeva sudjelovanje dvaju ključnih enzima (reverzne transkriptaze i DNA polimeraze), što onemogućuje pojednostavljenje rada reakcijskog sustava i smanjenje troškova.Ovdje ćemo predstaviti dvije reverzne transkriptaze otporne na visoke temperature, TtH i RevTaq.Ova dva enzima imaju i funkciju DNA polimeraze pa se nazivaju bifunkcionalni enzimi.

TtH DNA polimeraza

Sigurno ste čuli za TtH, koji se dobiva iz termofilne bakterije Thermus thermophilus HB8.U prisutnosti dvovalentnih kationa kao što je Mg2+, ima aktivnost DNA polimeraze.Široko se koristi u PCR reakcijama poput enzima Taq, ali ima veću otpornost na toplinu od enzima Taq, tako da također ima bolji učinak na PCR s predlošcima s visokim sadržajem GC.

· Ovaj enzim u osnovi nema aktivnost 3′→5′ egzonukleaze i aktivnost 5′→3′ egzonukleaze, tako da se također može koristiti za dideoksi sekvenciranje.

· Ovaj enzim ima aktivnost RTase.U prisutnosti Mn2+, aktivnost RTase će biti pojačana.Koristeći ovu značajku, može se koristiti za izvođenje reakcije obrnute transkripcije i PCR reakcije u istoj epruveti, to jest RT-PCR u jednom koraku.Međutim, u prisutnosti Mn2+, točnost RT-PCR nije visoka.RT aktivnost nema nikakve veze s aktivnošću rnaaze H.

· Povećana aktivnost Tth-DNA polimeraze (pH9, optimalno +55℃~+70℃, maksimalno +95℃) prevladava probleme uzrokovane sekundarnom strukturom RNA.Rezultirajuća cDNA može se umnožiti PCR-om s istim enzimom u prisutnosti iona Mg2+.

· Sposobnost Tth-DNA polimeraze da izvrši obrnutu transkripciju i pojačanje DNA na visokim temperaturama čini ovaj enzim korisnim za kvantitativnu RT-PCR, kloniranje i analizu ekspresije gena stanične i virusne RNA.
· Tth-DNA polimeraza se koristi za RT-PCR za umnožavanje RNA do 1kb.

ništavan
 

Značajke i prednosti

Tth DNA polimeraza:

• Osigurajte optimiziranu veličinu proizvoda lančane reakcije polimeraze (PCR), najmanje 1000 bp u RT-PCR reakciji

• Prihvatiti modificirani deoksiribonukleozid trifosfat kao supstrat

• Nije povezano s aktivnošću RNaze H

• Ima visoku toplinsku stabilnost za prevladavanje problema, obično povezanih s visokom sekundarnom strukturom prisutnom u RNA

RevTaq RT-PCR DNA polimeraza

DNA polimeraza otporna na toplinu s aktivnošću reverzne transkriptaze

RevTaq-RT-PCR-DNA polimeraza je projektirani, visoko otporan na toplinu, dvofunkcionalni enzim s aktivnostima reverzne transkriptaze i DNA polimeraze dobivenim usmjerenom i umjetnom evolucijom.

· Poluživot RevTaq RT-PCR DNA polimeraze na 95°C je duži od 40 minuta.

· RevTaq RT-PCR DNA polimeraza omogućuje visokotemperaturnu reverznu transkripciju izravno iz RNA predloška, ​​a korak obrnute transkripcije može se ponoviti više puta kako bi se stvorilo više cDNA predložaka.

· RevTaq RT-PCR DNA polimeraza dopušta "nulti korak" RT-PCR (bez izotermalnog koraka obrnute transkripcije), jer se u koraku produžetka cikličke PCR reverzna transkripcija i amplifikacija DNA događaju istovremeno.Ovo također potiče reakciju obrnute transkripcije na visokim temperaturama, čime se minimiziraju problemi koji se javljaju pri topljenju jake sekundarne strukture u RNA na visokim temperaturama.

· Zbog formule za vrući početak temeljene na aptameru, RevTaq RT-PCR DNA polimeraza će dati bolje rezultate kada je temperatura žarenja i ekstenzije viša od 57°C.

· Budući da je enzim otporan na toplinu, preporučuje se dizajn primera i sondi s vrlo visokim talištem (>60°C).

· Preporuča se optimizirati temperaturu koraka žarenja/ekstenzije kroz temperaturni gradijent tijekom procesa postavljanja reakcije.

· Što je viša temperatura, veća je specifičnost PCR-a.Ciklus obrnute transkripcije obično se izvodi na višoj temperaturi od PCR ciklusa, jer hibridizacija DNA Primer:RNA Template obično ima višu točku taljenja nego DNA Primer:cDNA Template duplex.

· RevTaq RT-PCR DNA polimeraza genetski je modificirana i optimizirana, a veličina amplikona je između 60-300 bp.

Granica detekcije RevTaq RT-PCR DNA polimeraze doseže 4 kopije/dva (2)

Optimizirani reakcijski sustav (uspostavljanje početnica s visokim talištem) prikazan je na slici.RevTaq RT-PCR RT-PCR vođen DNA polimerazom pokazuje bolju osjetljivost od glavne mješavine TaqPath RT-qPCR u 1 koraku i nižu detekciju gradijenta razrjeđenja uzorka.

Više prednosti:

Funkcija brzog pokretanja → Početni korak toplinske denaturacije može se preskočiti.

Hot-start aptamer formula → Omogućuje 100% aktivnost enzima odmah i sprječava nespecifično pojačanje na niskim temperaturama (<57°C).

Funkcija cijepanja → Korak ekstrakcije RNK je izostavljen jer RevTaq RT-PCR DNA polimeraza također može obraditi uzorke sirove reakcije.Može odmah uništiti stanične membrane eukariota, bakterija i virusa u vrućem RT-PCR ciklusu.

IVD razina sirovina → visoki standardi kvalitete i izuzetno konkurentne cijene


Vrijeme objave: 12. kolovoza 2021