Nedavno sam otkrio nešto nevjerojatno!Mnogi napredni eksperimentalni profesionalci oko njega ne znaju čak ni neke vrlo osnovne eksperimentalne točke znanja.

Na primjer, možete li odgovoriti na sljedeća pitanja?

Postoji li razlika između OD260 i A260?Što svaki znači?
OD je skraćenica za optičku gustoću (optička gustoća), A je kratica za apsorbanciju (apsorbanciju), dva su pojma zapravo ista, "optička gustoća" je "apsorbancija", ali "optička gustoća" je u skladu s većinom nacionalnih standarda i više je standardizirana.

Obično mjerimo OD vrijednost na 260 nm kako bismo izračunali koncentraciju nukleinske kiseline, pa što 1OD predstavlja?
Nukleinska kiselina ima maksimalnu apsorpciju na valnoj duljini od 260 nm, koja sadrži i DNA i RNA, kao i fragmentirane fragmente nukleinske kiseline (ovo je ključna točka).
Vrijednost OD izmjerena na valnoj duljini od 260 nm zabilježena je kao OD260.Ako je uzorak čist, vrijednost OD260 može izračunati koncentraciju uzorka nukleinske kiseline.
1 OD260=50 μg/ml dsDNA (dvolančana DNA)
=37 μg/ml ssDNA (jednolančana DNA)
=40 μg/ml RNA
=30 μg/ml dNTP (oligonukleotidi)
Postoji li veza i razlika između RT-PCR, Realtime-PCR i QPCR?
RT-PCR je skraćenica za reverznu transkripciju PCR
PCR u stvarnom vremenu=qPCR, skraćenica za kvantitativni PCR u stvarnom vremenu
Iako se čini da se PCR u stvarnom vremenu (fluorescentni kvantitativni PCR u stvarnom vremenu) i PCR s obrnutom transkripcijom (PCR s obrnutom transkripcijom) nazivaju skraćenicom RT-PCR.Ali međunarodna konvencija glasi: RT-PCR se posebno odnosi na PCR s obrnutom transkripcijom.

Koji su najčešće korišteni nt, bp i kb za opisivanje duljine DNA/RNA u biologiji?
nt = nukleotid
bp = par baza par baza
kb = kilobaza

Naravno, rekli biste da mnoge ljude ne zanimaju ti sitni detalji!Svi to rade, a nitko vas neće pitati što je to.Znate da je ovo nepotrebno, zar ne?

Ne, ne, ne, to je vrlo potrebno znati!zbog čega?
Jer želite objaviti članak!Brat!Bilo da namjeravate diplomirati ili se bavite znanstveno-istraživačkim postignućima, morate se osloniti na članke da biste govorili!

Ekstrakcija nukleinske kiseline trebala bi biti najjednostavniji i najosnovniji eksperiment.Kvaliteta ekstrakcije nukleinske kiseline izravno određuje rezultate naknadnih eksperimenata.

Iako sam to rekao mnogo puta, još uvijek ima mnogo prijatelja kojima nije stalo.Ovaj put sam se odlučio pomaknuti iz članka!

Minimum informacija za objavu kvantitativnih PCR eksperimenata u stvarnom vremenu, koji se nazivaju MIQE, skup je smjernica za kvantitativne pokuse fluorescencije pokrenut na međunarodnoj razini, koji predlažu minimalne standarde za eksperimentalne informacije potrebne za procjenu kvantitativnih PCR pokusa s fluorescencijom i objavljivanje članaka.Kroz eksperimentalne uvjete i metode analize koje daje eksperimentator, recenzenti mogu bolje procijeniti valjanost istraživačeve eksperimentalne sheme.

Može se vidjeti da su u odjeljku ekstrakcije nukleinske kiseline predložene sljedeće stavke detekcije,

"E" označava podatke koje je potrebno dostaviti, a "D" označava podatke koje treba dostaviti ako je potrebno.

Forma je vrlo komplicirana, zapravo, želim reći da svi trebaju krenuti od nje

čistoća (D), prinos (D), cjelovitost (E) i konzistencija (E) za procjenu nukleinskih kiselina u ova četiri aspekta.

Prema eksperimentalnim navikama, prvo razgovarajte o metodama procjene čistoće i koncentracije.

Mjerenje OD je omiljena i najlakša metoda detekcije za eksperimentatore.Što se tiče principa, neću ići u detalje.Mnogi laboratoriji sada koriste ultra-mikro spektrofotometre za izravnu kvantitativnu analizu uzoraka nukleinskih kiselina.Dok prikazuje vrijednost apsorbancije, program izravno daje vrijednost koncentracije (nukleinska kiselina, protein i fluorescentna boja) i povezane omjere.Što se tiče analize OD vrijednosti, spremite ovu sliku i bit ćete dobro.

Popis rješenja univerzalne OD vrijednosti

Međutim, postoji nekoliko upozorenja koja trebamo iznijeti zasebno za vas.

(Uostalom, znam da ste vi ti koji štedite i čekate dok vam ne zatrebaju!)

Napomena 1 Oprema

Na OD vrijednost će utjecati različita oprema.Sve dok je OD260 unutar određenog raspona, vrijednosti OD230 i OD280 su smislene.Na primjer, raspon apsorbancije uobičajenog Eppendorf D30 na 260 nm je 0~3 A, a NanoDrop One od Thermo je na 260 nm.Raspon apsorbancije od 0,5~62,5A.

Napomena 2Reagens za razrjeđivanje

Na vrijednost OD može utjecati razrjeđivanje različitih reagensa.Na primjer, očitanje OD260/280 pročišćene RNA u pH7,5 10 mM Trismeđuspremnik je između 1,9-2,1, dok je inneutralna vodena otopinaomjer će biti manji, možda samo 1,8-2,0, ali to ne znači da se kvaliteta RNA mijenja.

Napomena 3Zaostale tvari

Postojanje rezidualnih tvari utjecat će na točnost mjerenja koncentracije nukleinskih kiselina, stoga je potrebno izbjegavati proteinske, fenolne, polisaharide i polifenolne ostatke u uzorcima nukleinskih kiselina što je više moguće.

Međutim, zapravo je ekstrakcija organskim reagensima stara metoda.U komercijalnim setovima, učinak ekstrakcije može se postići putem adsorpcijske kolone na bazi silicijevog dioksida u kombinaciji s centrifugiranjem, izbjegavajući toksične i štetne organske reagense koje je teško ukloniti, itd. Problem, kao što jeForegeneov komplet za ekstrakciju nukleinske kiseline, ne koristi DNazu/RNazu i toksične organske reagense tijekom cijele operacije, brzo i sigurno, iučinak jedobro(slučajno sam rekao da je ćelav, ali znam da želiš znati).

Primjer 1: Prinos i čistoća ekstrakcije genomske DNA

Foregene Soil DNA Isolation Kit (DE-05511) obrađuje uzorke tla iz različitih izvora, a količina i čistoća dobivene genomske DNA prikazani su u sljedećoj tablici:
Primjer 2: Prinos i čistoća ekstrakcije tkivne RNA

Animal Total RNA Isolation Kit (RE-03012) obradio je različite uzorke tkiva, a količina i čistoća dobivene RNA prikazani su u tablici ispod (za mišje tkivo):
Međutim, nemojte misliti da ste gotovi s OD vrijednošću.Imate li ikakvog odgovora na ključne točke koje sam vam nacrtao naprijed?

Obavijest

Fragmentirane molekule nukleinske kiseline također će se izračunati u apsorbanciji.Pod pretpostavkom da imate ostatke genomske DNA u RNA, vaša OD vrijednost će se činiti vrlo visokom, ali stvarna koncentracija RNA ne može se odrediti.Je li vaša RNA Nije jasno postoji li degradacija, pa nam je još uvijek potrebna sveobuhvatna metoda procjene kako bismo dali točniju prosudbu, odnosno procjena integriteta nukleinske kiseline spomenuta u MIQE.