Budući da je nova u laboratoriju, nije dobro izdvajati pozitivne biljke iz gomile biljaka s niskom stopom konverzije.Najprije se DNK mora ekstrahirati iz velikog broja uzoraka jedan po jedan, a zatim će se PCR-om detektirati strani geni.Međutim, rezultati su često prazni i povremeno se nalaze trake s nekoliko stavki, ali je nemoguće utvrditi ima li propuštenih detekcija ili lažnih detekcija..Je li vrlo bespomoćno suočiti se s takvim eksperimentalnim procesom i rezultatima?Ne brini, brate te uči kako lako i točno izdvojiti transgene pozitivne biljke.

Korak 1

Primeri za otkrivanje dizajna

Odredite endogeni gen i egzogeni gen koji treba otkriti prema uzorku koji se testira i odaberite reprezentativnu sekvencu od 100-500 bp u genu za dizajn početnice.Dobri primeri mogu osigurati točnost rezultata detekcije i skratiti vrijeme detekcije (pogledajte dodatak za najčešće korištene primere detekcije).

Napomena: Novodizajnirani primeri moraju optimizirati uvjete reakcije i potvrditi točnost, preciznost i granicu detekcije prije velike detekcije.

Korak 2

Dizajn eksperimentalnog protokola

Pozitivna kontrola: Upotrijebite pročišćenu DNK koja sadrži ciljni fragment kao predložak za određivanje jesu li PCR reakcijski sustav i uvjeti normalni.

Negativna/slijepa kontrola: Upotrijebite predložak DNK ili ddH2O koji ne sadrži ciljani fragment kao predložak da otkrijete postoji li izvor kontaminacije u PCR sustavu.

Unutarnja referentna kontrola: upotrijebite kombinaciju početnica/sonde endogenog gena uzorka koji se testira kako biste procijenili može li se uzorak detektirati PCR-om.

Obavijest:

Pozitivne, negativne/slijepe kontrole i interne kontrole treba postaviti za svaki test kako bi se procijenila valjanost eksperimentalnih rezultata.

Priprema pokusa

Prije upotrebe provjerite je li otopina ravnomjerno izmiješana.Ako se nađe talog, potrebno ga je prije upotrebe otopiti i promiješati prema uputama.2×PCR mješavinu potrebno je pipetirati i više puta miješati mikropipetom prije upotrebe kako bi se izbjegla neravnomjerna raspodjela iona.

Obavijest:

Izvadite priručnik i pažljivo ga pročitajte te izvršite pripreme prije pokusa u strogom skladu sa zahtjevima priručnika.

Korak 4

Pripremite PCR reakcijski sustav

U skladu s eksperimentalnim protokolom, ravnomjerno pomiješajte početnice, H2O i 2×PCR, centrifugirajte i rasporedite ih u svaku reakcijsku epruvetu.

Obavijest:

Za opsežna ili dugotrajna testiranja preporučuje se korištenje PCR reakcijskog sustava koji sadrži enzim UNG, koji može učinkovito izbjeći kontaminaciju aerosolom uzrokovanu PCR proizvodima.

Korak 5

Dodajte predložak reakcije

Korištenjem Direct PCR tehnologije, nema potrebe za dosadnim procesom pročišćavanja nukleinske kiseline, uzorak uzorka može se pripremiti unutar 10 minuta, a može se dodati i odgovarajući PCR reakcijski sustav.

Obavijest:

Metoda cijepanja ima bolji učinak detekcije, a dobiveni proizvod se može koristiti za više reakcija detekcije.

5.1: Izravno širenje lišća

Prema veličini slike u priručniku, izrežite lisno tkivo promjera 2-3 mm i stavite ga u PCR reakcijski sustav.

Napomena: Provjerite jesu li dijelovi listova potpuno uronjeni u PCR reakcijsku otopinu i nemojte dodavati previše lisnog tkiva.

5.2: Metoda razdvajanja listova

Izrežite tkivo lista promjera 5-7 mm i stavite ga u epruvetu za centrifugiranje.Ako odaberete zrelo lišće, izbjegavajte korištenje tkiva glavne žile lista.Pipetirajte 50 ul pufera P1 lizata u epruvetu za centrifugu kako biste bili sigurni da lizat može potpuno uroniti tkivo lista, stavite ga u termalni cikler ili metalnu kupelj i lizirajte na 95°C 5-10 minuta.

Dodajte 50 ul otopine za neutralizaciju pufera P2 i dobro promiješajte.Dobiveni lizat može se koristiti kao predložak i dodati u PCR reakcijski sustav.

Napomena: Količina predloška je između 5-10% PCR sustava i ne smije prelaziti 20% (na primjer, u 20 μl PCR sustavu dodajte 1-2 μl otopine za lizu, ne više od 4 μl).

Korak 6

PCR reakcija

Nakon centrifugiranja PCR reakcijske epruvete, ona se stavlja u PCR instrument za umnožavanje.

Obavijest:

Reakcija koristi nepročišćeni šablon za amplificiranje, tako da je broj ciklusa amplifikacije 5-10 ciklusa više nego kada se koristi pročišćeni DNA šablon.

Korak 7

Detekcija elektroforezom i analiza rezultata

M: DNA ljestve od 100 bp

1\4: Metoda pročišćene DNA

2\5: Izravna PCR metoda

3\6: Prazna kontrola

QC:

Rezultati ispitivanja različitih kontrola postavljenih u eksperimentu trebaju ispunjavati sljedeće uvjete.U suprotnom, potrebno je analizirati uzrok problema i ponoviti test nakon otklanjanja problema.

Tablica 1. Normalni rezultati ispitivanja različitih kontrolnih skupina

*Kada se plazmid koristi kao pozitivna kontrola, rezultat testa endogenog gena može biti negativan

Procjena rezultata:

A. Rezultat testa endogenog gena uzorka je negativan, što ukazuje da se DNA prikladna za običnu PCR detekciju ne može ekstrahirati iz uzorka ili ekstrahirana DNA sadrži inhibitore PCR reakcije, te DNA treba ponovno ekstrahirati.

B. Rezultat testa endogenog gena uzorka je pozitivan, a rezultat testa egzogenog gena je negativan, što ukazuje da je iz uzorka ekstrahirana DNA pogodna za običnu PCR detekciju, te se može procijeniti da gen XXX nije detektiran u uzorku.

C. Rezultat testa endogenog gena uzorka je pozitivan, a rezultat testa egzogenog gena je pozitivan, što znači da je iz uzorka ekstrahirana DNK prikladna za običnu PCR detekciju, a DNK uzorka sadrži XXX gen.Eksperimenti potvrde mogu se dalje provoditi.

Korak 8

Primeri za otkrivanje dizajna

Nakon eksperimenta, upotrijebite 2% otopinu natrijeva hipoklorita i 70% otopinu etanola za brisanje eksperimentalnog područja kako biste spriječili onečišćenje okoliša.