Specifičnost detekcije
U većini slučajeva, svrha dizajna primera je maksimiziranje specifičnosti PCR-a.To je određeno više ili manje predvidljivim utjecajem mnogih varijabli.Jedna važna varijabla je sekvenca na 3′ kraju početnice.
Važno je da će PCR testovi dizajnirani za specifičnost vjerojatnije održati visoku učinkovitost u širokom dinamičkom rasponu, jer test ne proizvodi nespecifične produkte amplifikacije, čime se natječe s PCR reagensima ili inhibira glavnu reakciju amplifikacije.
Naravno, u nekim slučajevima specifičnost nije najvažnija, na primjer, kada je cilj kvantificirati blisko povezane, ali različite patogene, potrebni su posebni standardi dizajna, optimizacije i verifikacije.
Krivulja taljenja je standardna metoda za procjenu specifičnosti amplikona, barem u smislu treba li pojačati jednu metu.Međutim, mora se naglasiti da krivulje taljenja mogu dovesti u zabludu jer, na primjer, na njih mogu utjecati kombinirani učinci suboptimalnih primera i niskih koncentracija šablona.
P5 |Krivulja taljenja pokazuje Tm pomake dobivene iz dvije detekcije različitih količina dviju ciljnih DNA.
A. Pri višim koncentracijama (ad)), nema očitog dimera primera nakon završetka qPCR mjerenja.Kako se koncentracija predloška smanjuje na 50 kopija (e), počinje se pojavljivati nespecifični proizvod i postaje jedini proizvod s najnižom koncentracijom (f).
B. Test je zabilježio isti Tms pri svim ciljnim koncentracijama, a nije bilo očitog dimera početnice čak ni kod najniže koncentracije (5 kopija).Pri korištenju ove dvije metode detekcije nisu detektirani nikakvi produkti pojačanja u NTC-ima.
P5 prikazuje krivulje otapanja dobivene s uzorcima u kojima je predložak prisutan u različitim koncentracijama.P 5a pokazuje da su pri dvije najniže koncentracije, Tms proizvedenih nespecifičnih produkata pojačanja niži od Tms specifičnih amplikona.
Očito je da se ova metoda detekcije ne može pouzdano koristiti za otkrivanje ciljeva koji postoje u niskim koncentracijama.
Zanimljivo je da NTC, tj. uzorci bez DNK uopće, nisu zabilježili (nespecifične) produkte amplifikacije, što ukazuje da pozadinska genomska DNK može sudjelovati u nespecifičnoj amplificiranju/polimerizaciji.
Ponekad se takvi pozadinski primeri i nespecifična amplifikacija ne mogu ispraviti, ali često je moguće osmisliti metodu detekcije koja nema nespecifičnu amplifikacije u bilo kojoj koncentraciji predloška i NTC (P 5b).
Ovdje će čak i bilježenje pojačanja ciljane koncentracije s Cq od 35 proizvesti specifičnu krivulju otapanja.Slično, NTC nisu pokazivali znakove nespecifičnog pojačanja.Ponekad ponašanje detekcije može ovisiti o matičnoj tekućini, au određenim sastavima pufera otkriva se samo nespecifično pojačanje, što može biti povezano s različitim koncentracijama Mg2+.
Stabilnost detekcije
Optimizacija Ta koristan je korak u empirijskoj provjeri i procesu optimizacije qPCR detekcije.Omogućuje izravnu indikaciju robusnosti kompleta primera pokazujući temperaturu (ili raspon temperature) koja proizvodi najniži Cq bez pojačanja NTC.
Dvostruka do četverostruka razlika u osjetljivosti možda nije važna za ljude s visokom ekspresijom mRNA, ali za dijagnostičke testove može značiti razliku između pozitivnih i lažno negativnih rezultata.
Ta svojstva qPCR početnica mogu uvelike varirati.Neki testovi nisu jako robusni i ako se ne izvode pod optimalnom Ta vrijednošću početnica, brzo će propasti.
Ovo je važno jer je ova vrsta detekcije često problematična u stvarnom svijetu, a čistoća uzorka, koncentracija DNK ili prisutnost druge DNK možda neće biti optimalni.
Osim toga, ciljni broj kopija može varirati u širokom rasponu, a reagensi, plastično posuđe ili instrumenti mogu se razlikovati od onih korištenih prilikom postavljanja testa.
P6|Gradijent temperature pokazuje različitu robusnost PCR detekcije.
A. Upotrijebite Bioline Sensifast SYBR mastermix (kataloški broj BIO-98050) za provođenje PCR-a na cDNA pripremljenoj iz RNA ljudskog mozga.
B. Upotrijebite Bio-Rad CFX qPCR instrument za snimanje mape pojačanja i krivulje otapanja apalena (NM_033207, F: GCCATGGAGGAAAGTGACAGACC, R: CTCATGTGTGGGTGATCTCCTAGG).
C. Grafikon pojačanja i krivulja taljenja ACSBG1 (NM_015162.4, F: CTACACTTCCGGCACCACTGG, R: GTCCACGTGATATTGTCTTGACTCAG).
D. Grafikon amplifikacije i krivulja otapanja GFAP (NM_002055.5, F: TGGAGAGGAAGATTGAGTCGCTGG, R: CGAACCTCCTCCTCGTGGATCTTC).
E. Cqs zabilježen pri različitim temperaturama žarenja, pokazujući razliku u Cq zabilježenu pod temperaturnim gradijentom od 7C.
P 6 prikazuje tipičan rezultat nepoželjnog testa, gdje je qPCR izveden korištenjem gradijenta Tas između 59C i 67C (P 6a), koristeći početnice za tri gena specifična za ljudski mozak.
Iz dijagrama pojačanja može se vidjeti da su Opalin primeri daleko od idealnih jer je njihov optimalni Ta raspon vrlo uzak (Slika 6b), to jest, Cqs su široko raspršeni, što rezultira značajnom usporedbom Cqs s njihovim optimalnim Cqs Low.
Ova metoda detekcije je nestabilna i može dovesti do suboptimalnog pojačanja.Stoga bi ovaj par početnica trebalo redizajnirati.Osim toga, analiza krivulje taljenja (umetnuti) pokazuje da specifičnost ove metode detekcije također može biti problematična, jer je krivulja taljenja svakog Ta različita.
Metoda detekcije ACSBG1 prikazana u P 6c je robusnija od gore navedene metode detekcije Opalin, ali je još uvijek daleko od idealne i vjerojatno je da se može poboljšati.
Međutim, naglašavamo da ne postoji nužna veza između robusnosti i specifičnosti, jer krivulja otapanja dobivena ovom metodom detekcije pokazuje istu vršnu vrijednost u svim Tas (umetnuti).
S druge strane, test robusnosti mnogo je tolerantniji, proizvodeći slične Cq u širokom rasponu Tas, kao u GFAP testu prikazanom u P 6d.
Razlika u Cqs dobivena u istom rasponu od 8 stupnjeva Celzijusa manja je od 1, a krivulja otapanja (umetnuti) potvrđuje karakteristike detekcije u ovom temperaturnom rasponu.Vrijedno je napomenuti da se izračunati Tas i stvarni Ta raspon mogu jako razlikovati.
Postoje mnoge smjernice osmišljene kako bi pomogle istraživačima u dizajniranju učinkovitih početnica, od kojih se većina temelji na davno utvrđenim pravilima, a puno je pozornosti posvećeno 3'kraju početnica.Često se preporučuje uključivanje G ili C na 3' kraju i dvije G ili C baze (GC stezaljka), ali ne više od dvije od zadnjih 5 baza.
U praksi ova pravila mogu voditi istraživače, ali nisu nužno točna u svim okolnostima.
P7 |3′ kraj početnice ima mali učinak na specifičnost ili učinkovitost.
A. Položaj početnica za ljudski HIF-1α (NM_181054.2) gen.
B. Upotrijebite matičnu tekućinu Agilent Brilliant III SYBR Green (kat. br. 600882) za pojačanje šest ispitnih stavki.
C. Grafikon amplifikacije i krivulja taljenja snimljeni Bio-Radovim CFX qPCR instrumentom i 3'end primerima.NTC su prikazani crvenom bojom.
D. Cqs zapis svake ispitne stavke
Na primjer, rezultat u P 7 proturječi pravilu 3'end.Svi dizajni daju u osnovi iste rezultate, sa samo dvije kombinacije početnica koje dovode do nespecifičnog pojačanja u NTC.
Međutim, ne možemo podržati učinak GC isječka, jer u ovom slučaju korištenje A ili T kao najviše 30 baza ne smanjuje specifičnost.
Test C, gdje F početnica završava na GGCC, zabilježio je Cqs u NTC-ovima, što ukazuje da bi netko možda želio izbjeći ove sekvence na 30-kraju.Naglašavamo da je jedini način da se odredi najbolja sekvenca na 3′ kraju para primera eksperimentalna procjena nekih početnica kandidata.
Učinkovitost pojačanja
Važno je, iako nespecifična PCR detekcija nikada ne može postati specifična, učinkovitost amplifikacije može se prilagoditi i maksimizirati na mnogo različitih načina promjenom enzima, matične tekućine, aditiva i uvjeta ciklusa.
Za procjenu učinkovitosti detekcije PCR-om, najbolje je koristiti serijsko razrjeđenje 10 ili 5 puta ciljne nukleinske kiseline, odnosno "metodu standardne krivulje".
Ako se za generiranje standardne krivulje koriste PCR amplikoni ili sintetičke DNA mete, serijska razrjeđenja tih meta trebaju se miješati s konstantnom količinom pozadinske DNA (kao što je genomska DNA).
P8 |Krivulja razrjeđivanja za procjenu učinkovitosti PCR-a.
A. Koristite primere za HIF-1: F: AAGAACTTTTAGGCCGCTCA i R: TGTCCTGTGGTGACTTGTCC i Agilentov Brilliant III SYBR Green mastermix (kataloški broj 600882) za PCR i uvjete krivulje taljenja.
B. 100 ng RNA je reverzno transkribirano, razrijeđeno 2 puta, a serijski razrijeđeni uzorci cDNA su razrijeđeni 5 puta do 1 ng ljudske genomske DNA.Na umetku je prikazana krivulja taljenja.
C. RT reakcija, razrjeđivanje i serijsko razrjeđivanje ponovljeni su za drugi uzorak cDNA, a rezultati su bili slični.
P 8 prikazuje dvije standardne krivulje, koristeći istu metodu detekcije na dva različita uzorka cDNA, rezultat je ista učinkovitost, oko 100%, a vrijednost R2 je također slična, to jest, stupanj podudaranja između eksperimentalnih podataka i regresijske linije ili stupnja linearnosti podataka.
Dvije standardne krivulje su usporedive, ali nisu potpuno iste.Ako je svrha točno kvantificirati cilj, mora se napomenuti da je neprihvatljivo dati izračun broja kopija bez objašnjenja nesigurnosti
P9 |Mjerna nesigurnost povezana s kvantifikacijom pomoću standardne krivulje.
A. Upotrijebite početnice za GAPDH (NM_002046) za provođenje PCR i uvjeta krivulje taljenja.F: ACAGTTGCCATGTAGACC i R: TAACTGGTTGAGCACAGG i Bioline Sensifast SYBR mastermix (kataloški broj BIO-98050).
B. Dijagram pojačanja, krivulja taljenja i standardna krivulja snimljene Bio-Radovim CFX qPCR instrumentom.
C. Grafikon standardne krivulje i 95% interval pouzdanosti (CI).
D. Broj kopija i 95% interval pouzdanosti triju vrijednosti Cq izvedenih iz krivulje razrjeđivanja.
P 9 pokazuje da je za optimizirani test inherentna varijabilnost jedne standardne krivulje približno 2 puta (95% interval pouzdanosti, minimum do maksimum), što može biti najmanja varijabilnost koja se može očekivati.
Povezani proizvod:
Animal Tissue Direct PCR komplet
Vrijeme objave: 30. rujna 2021
