• facebook
  • linkedin
  • youtube

Nekoliko revolucionarnih izuma u povijesti tehnologije detekcije po mom mišljenju su tehnologija imunooznačavanja koja se temelji na principu specifičnog vezanja antigen-antitijelo, PCR tehnologija i tehnologija sekvenciranja.Danas ćemo govoriti o PCR tehnologiji.Prema evoluciji PCR tehnologije, ljudi uobičajeno dijele PCR tehnologiju u tri generacije: obična PCR tehnologija, fluorescentna kvantitativna PCR tehnologija u stvarnom vremenu i digitalna PCR tehnologija.

Cuobičajena PCR tehnika

w1

KARY MULLIS (1944.28.12.-2019.8.7.)

Kary Mullis izumio je lančanu reakciju polimerazom (lančana reakcija polimeraze, PCR) 1983. Priča se da je, dok je vozio svoju djevojku, iznenada dobio bljesak inspiracije i pomislio na princip PCR-a (o prednostima vožnje).Kary Mullis dobio je Nobelovu nagradu za kemiju 1993. New York Times komentirao je: "Vrlo originalan i značajan, gotovo dijeleći biologiju na razdoblja prije i nakon PCR-a.

Načelo PCR-a: pod katalizom DNA polimeraze, matični lanac DNA koristi se kao predložak, a specifična početnica se koristi kao početna točka produljenja, a DNK kćeri lanac komplementaran matičnom DNK predloška se kopira in vitro kroz denaturaciju, žarenje, produljenje i druge korake.To je tehnologija pojačanja sinteze DNK in vitro, koja može brzo i specifično pojačati bilo koju ciljanu DNK in vitro.

w2

Prednosti običnog PCR-a
1.Klasična metoda, kompletni međunarodni i domaći standardi
2.Niža cijena reagensa za instrumente
3.PCR proizvodi se mogu oporaviti za druge pokuse molekularne biologije
Preporučeni Foregene PCR uređaj: https://www.foreivd.com/foreamp-sn-695-series-thermal-cycler-96-wells-pcr-machine-product/
Povezani proizvodi: https://www.foreivd.com/pcr-herotm-with-dye-product/
Nedostaci običnog PCR-a
1.lako zagaditi
2.glomazna operacija
3.samo kvalitativna analiza
4.Umjerena osjetljivost
5.Postoji nespecifična amplifikacija, a kada je nespecifična traka iste veličine kao ciljna traka, ne može se razlikovati
 
CPCR na bazi apilarne elektroforeze
Kao odgovor na nedostatke obične PCR, neki proizvođači su uveli instrumente koji se temelje na principu kapilarne elektroforeze.Korak elektroforeze nakon PCR amplifikacije je završen u kapilari.Osjetljivost je veća, a MAERKER može razlučiti razliku nekoliko baza i izračunati pojačanje.sadržaj proizvoda.Nedostatak je što PCR produkt ipak treba otvoriti i staviti u instrument, a još uvijek postoji veliki rizik od kontaminacije.

w3

CapilarniEelektroforeza

 

2. Fluorescentna kvantitativna PCR tehnologija u stvarnom vremenu (Quantitative Real-time PCR, qPCR)Fluorescentni kvantitativni PCR, također nazvan Real-Time PCR, nova je kvantitativna tehnologija nukleinske kiseline koju je razvio PE (Perkin Elmer) 1995. Povijest razvoja fluorescentnog kvantitativnog PCR-a povijest je dirljivih borbi divova kao što su ABI, Roche i Bio-Rad.Ako ste zainteresirani, možete pogledati.Ova tehnika trenutno je najzrelija i najraširenija polukvantitativna PCR tehnika.

Preporučeni qPCR uređaj: https://www.foreivd.com/mini-real-time-pcr-system-forequant-sf2sf4-product/

Metoda fluorescentne boje (SYBR Green I):SYBR Green I je najčešće korištena boja za vezanje DNK za kvantitativni PCR, koja se nespecifično veže na dvolančanu DNK.U slobodnom stanju, SYBR Green emitira slabu fluorescenciju, ali kada se veže za dvolančanu DNK, njegova fluorescencija se povećava 1000 puta.Stoga je ukupni fluorescentni signal koji emitira reakcija proporcionalan količini prisutne dvolančane DNA i povećavat će se s povećanjem umnoženog produkta.Budući da se boja nespecifično veže za dvolančanu DNK, mogu se dobiti lažno pozitivni rezultati.

Povezani proizvodi: https://www.foreivd.com/real-time-pcr-easytm-sybr-green-i-kit-product/

Metoda fluorescentne sonde (Taqman tehnologija): TijekomPCR amplifikacija, specifična fluorescentna sonda se dodaje u isto vrijeme kao i par primera.Proba je linearni oligonukleotid, s fluorescentnom reporterskom skupinom i fluorescentnom skupinom za gašenje obilježenom na oba kraja.Kada je sonda netaknuta, fluorescentni signal koji emitira reporterska grupa apsorbira grupa za gašenje, a detekcija Nema fluorescentnog signala;tijekom PCR pojačanja (u fazi ekstenzije), 5'-3' Dicer aktivnost Taq enzima će probaviti i razgraditi sondu, tako da su reporterska fluorescentna skupina i quencher fluorescentna skupina odvojene, tako da se sustav za praćenje fluorescencije može primiti, to jest, svaki put kada se lanac DNA pojača, formira se fluorescentna molekula, koja ostvaruje potpunu sinkronizaciju nakupljanja fluorescentnih signala i stvaranja PCR produkata.Taqmanova metoda sonde je najčešće korištena metoda detekcije u kliničkoj detekciji.

Povezani proizvodi: https://www.foreivd.com/quickeasy%e1%b5%80%e1%b4%b9-real-time-pcr-kit-taqman-product/

w4

Prednosti qPCR-a
1.Metoda je zrela, a prateća oprema i reagensi su dovršeni
2.Srednji trošak reagensa
3.jednostavan za korištenje
4.Visoka osjetljivost i specifičnost detekcije
 
Nedostaci qPCR-a

Mutacija ciljnog gena dovodi do propuštene detekcije.
Rezultat detekcije šablona niske koncentracije ne može se odrediti.
Postoji velika pogreška pri korištenju standardne krivulje za kvantitativnu detekciju.
 
3. Digitalna PCR (digitalna PCR, dPCR) tehnologija
Digitalni PCR je tehnika za apsolutnu kvantifikaciju molekula nukleinskih kiselina.U usporedbi s qPCR-om, digitalni PCR može izravno očitati broj molekula DNA/RNA, što je apsolutna kvantifikacija molekula nukleinske kiseline u početnom uzorku.Godine 1999. Bert Vogelstein i Kenneth W. Kin-zler službeno su predložili koncept dPCR-a.
 
Godine 2006. Fluidigm je prvi proizveo komercijalni dPCR instrument temeljen na čipu.Godine 2009. Life Technologies lansirao je OpenArray i QuantStudio 12K Flex dPCR sustave.Life Technologies je 2013. lansirao QuantStudio 3DdPCR sustav, koji koristi tehnologiju mikrofluidnih čipova visoke gustoće za ravnomjernu distribuciju uzoraka u 20.000 pojedinačnih stanica.u reakcijskom zdencu.

w5

Godine 2011. Bio-Rad je lansirao QX100 dPCR instrument temeljen na kapljicama, koji koristi tehnologiju vode u ulju za ravnomjernu raspodjelu uzorka na 20 000 kapljica vode u ulju, te koristi analizator kapljica za analizu kapljica.RainDance je 2012. lansirao instrument RainDrop dPCR, pokretan plinom visokog tlaka, za dijeljenje svakog standardnog reakcijskog sustava u reakcijsku emulziju koja sadrži 1 milijun do 10 milijuna mikrokapljica na razini pikolitara.

w6

Do sada je digitalni PCR formirao dvije glavne frakcije, vrstu čipa i vrstu kapljica.Bez obzira na vrstu digitalnog PCR-a, njegovi temeljni principi su ograničavanje razrjeđenja, PCR krajnje točke i Poissonova distribucija.Standardni PCR reakcijski sustav koji sadrži predloške nukleinske kiseline ravnomjerno je podijeljen na desetke tisuća PCR reakcija, koje su raspoređene na čipove ili mikrokapljice, tako da svaka reakcija sadrži što je moguće više molekule predloška, ​​te se izvodi PCR reakcija jedne molekule predloška.Očitavanjem fluorescencije Broji se prisutnost ili odsutnost signala, a apsolutna kvantifikacija se izvodi nakon kalibracije statističke Poissonove distribucije.

Sljedeće su karakteristike nekoliko digitalnih PCR platformi koje sam koristio:

1. Bio-Rad QX200 kapljični digitalni PCR Bio-RadQX200 je vrlo klasična digitalna PCR platforma, osnovni proces detekcije: 20 000 uzoraka generira generator kapljica. Mikrokapljice vode u ulju pojačavaju se na običnom PCR stroju, a na kraju fluorescentni signal svake mikrokapljice očitava čitač mikrokapljica.Operacija je složenija, a rizik od onečišćenja je srednji.

w7

Xinyi TD1 mikrokapljični digitalni PCRXinyi TD1 je domaća digitalna PCR platforma, osnovni proces detekcije: generiranje 30 000-50 000 kapljica vode u ulju kroz generator kapljica, pojačavanje na uobičajenom PCR instrumentu i konačno prolazak. Čitač kapljica očitava fluorescentni signal svake kapljice.I stvaranje kapljica i očitavanje u ovoj platformi izvode se u namjenskom čipu s niskim rizikom od kontaminacije.

w8

 STILLA Naica mikro-kapljični čip digitalni PCRSTILLA Naica je relativno nova digitalna PCR platforma.Osnovni proces detekcije je: dodajte reakcijsku otopinu u čip, stavite čip u sustav za stvaranje i pojačavanje mikrokapljica i generirajte 30 000 mikrokapljica.Raširite po čipu i PCR pojačanje je dovršeno na čipu.Zatim se pojačani čip prenosi u sustav za analizu očitavanja mikrokapljica, a fluorescentni signal se očitava snimanjem slika.Budući da se cijeli proces odvija u zatvorenom čipu, rizik od kontaminacije je nizak.

w9

4. ThermoFisher QuantStudio 3D čip digitalni PCR

ThermoFisher QuantStudio 3D još je jedna klasična digitalna PCR platforma temeljena na čipu.Njegov osnovni postupak detekcije je: dodajte reakcijsku otopinu u raspršivač i ravnomjerno rasporedite reakcijsku otopinu na čipu s 20 000 mikrojažica kroz raspršivač., stavite čip na PCR stroj da se pojača, i na kraju stavite čip u čitač i snimite fotografiju da očitate fluorescentni signal.Operacija je relativno komplicirana, a cijeli proces se odvija u zatvorenom čipu, a rizik od kontaminacije je nizak.

w10

5. JN MEDSYS Clarity chip digitalni PCR

JN MEDSYS Clarity je relativno nova digitalna PCR platforma tipa čipa.Njegov osnovni postupak detekcije je: dodajte reakcijsku otopinu u aplikator i ravnomjerno rasporedite reakcijsku otopinu na 10 000 PCR epruveta pričvršćenih u PCR epruveti kroz aplikator.Na mikroporoznom čipu, reakcijska otopina ulazi u čip kapilarnim djelovanjem, a PCR epruveta s čipom postavlja se na PCR stroj radi pojačanja, a na kraju se čip stavlja u čitač za očitavanje fluorescentnog signala snimanjem fotografije.Operacija je kompliciranija.Rizik od kontaminacije je nizak.

w11

Parametri svake digitalne PCR platforme su sažeti kako slijedi:

w12

Pokazatelji evaluacije digitalne PCR platforme su: broj podijeljenih jedinica, broj fluorescentnih kanala, složenost rada i rizik od kontaminacije.Ali najvažnija stvar je točnost detekcije.Jedan od načina za procjenu digitalnih PCR platformi je korištenje više digitalnih PCR platformi za provjeru jedne druge, a drugi način je korištenje standardnih tvari s točnim vrijednostima.

Prednosti dPCR-a
1.Postizanje apsolutne kvantifikacije
2.Veća osjetljivost i specifičnost
3.Može detektirati uzorke niske kopije
Nedostaci dPCR-a1. Skupa oprema i reagensi 2. Kompliciran rad i dugo vrijeme detekcije 3. Uzak raspon detekcije

Trenutačno tri generacije PCR tehnologije imaju svoje prednosti i nedostatke, a svaka ima svoja područja primjene i nije odnos da jedna generacija zamjenjuje drugu.Stalni napredak tehnologije ubrizgao je novu vitalnost u PCR tehnologiju, omogućujući joj da otključa jedan smjer primjene za drugim, čineći detekciju nukleinske kiseline praktičnijom i točnijom.
Izvor: Dr. Yuan vas vodi na testiranje
 
Preporučeni proizvodi:


Vrijeme objave: 18. studenog 2022