• facebook
  • linkedin
  • youtube

PCR je najraširenija tehnologija umnožavanja nukleinskih kiselina i naširoko se koristi zbog svoje osjetljivosti i specifičnosti.Međutim, PCR zahtijeva ponovljenu toplinsku denaturaciju i ne može se riješiti ograničenja oslanjanja na instrumente i opremu, što ograničava njegovu primjenu u kliničkim ispitivanjima na terenu.

Od ranih 1990-ih mnogi su laboratoriji počeli razvijati tehnologiju pojačanja konstantne temperature koja ne zahtijeva toplinsku denaturaciju.Sada su razvili tehnologiju izotermalne amplifikacije posredovane petljom, tehnologiju izotermalne amplifikacije zamjenom lanca, tehnologiju izotermne amplifikacije s kotrljajućim krugom i ovisnost o sekvenci nukleinskih kiselina.Tehnologija izotermalnog pojačanja i druge tehnologije. 

Loop-posredovano izotermno pojačanje

Načelo umnožavanja temelji se na činjenici da je DNK u stanju dinamičke ravnoteže na oko 65°C.Kada je bilo koji primer uparen bazama i proširen na komplementarni dio dvolančane DNA, drugi lanac će se odvojiti i postati jednolančani.

Na ovoj temperaturi, DNK koristi 4 specifična početnica kako bi se oslanjala na DNA polimerazu s pomicanjem lanca kako bi sinteza DNA s pomicanjem lanca kontinuirano sama cirkulirala.

Prvo odredite 6 specifičnih regija F3, F2, F1, B1, B2, B3 na ciljnom genu, a zatim dizajnirajte 4 početnice na temelju tih 6 specifičnih regija (kao što je prikazano na slici ispod):

Prednja unutarnja početnica (FIP) sastoji se od F1c i F2.

Unutarnji početni početni sloj (BIP) sastoji se od B1c i B2, a TTTT se koristi kao razmaknica u sredini.

Vanjski primeri F3 i B3 sastavljeni su od regija F3 i B3 na ciljnom genu.

Tehnologija izotermne amplifikacije nukleinskih kiselina

U reakcijskom sustavu LAMP, koncentracija unutarnjeg klica je nekoliko puta veća od koncentracije vanjskog klica.Unutarnji primer se prvo kombinira s predloškom lanca kako bi se sintetizirao komplementarni lanac i formirao dvostruki lanac DNA.Nakon toga, vanjski primer se kombinira s predloškom niti kako bi se formirao dvostruki lanac DNA.Pod djelovanjem BstDNA polimeraze oslobađa se komplementarni lanac sintetiziran unutarnjim početnim slojem.Nakon niza reakcija, komplementarni lanac konačno formira jedan lanac DNK sa strukturom bučice.

Sama pojedinačna nit DNA strukture bućice koristi se kao predložak za kontinuirano formiranje prijelazne DNA strukture petlje s otvorenim krajem.Unutarnji i vanjski prajmeri usmjeravaju prijelaznu strukturu petlje stabljike DNA da se kontinuirano podvrgava reakcijama pomicanja lanaca i produžavanja, te na kraju formira višestruke strukture petlje stabljike različitih duljina.DNA mješavina.

Tehnologija izotermne amplifikacije nukleinskih kiselina2

Prednosti i nedostaci izotermnog pojačanja posredovanog petljom

Prednosti LAMP-e:

(1) Visoka učinkovitost amplifikacije, koja može učinkovito amplificirati 1-10 kopija ciljnog gena unutar 1 sata, a učinkovitost amplifikacije je 10-100 puta veća od običnog PCR-a.

(2) Vrijeme reakcije je kratko, specifičnost je jaka i nije potrebna posebna oprema.

Nedostaci LAMP-a:

(1) Zahtjevi za temeljne premaze su posebno visoki.

(2) Umnoženi produkt ne može se koristiti za kloniranje i sekvenciranje, već samo za prosudbu.

(3) Zbog svoje jake osjetljivosti, lako je formirati aerosole, uzrokujući lažno pozitivne rezultate i utječući na rezultate ispitivanja.

Strand displacement pojačanje

Amplifikacija pomakom lanca (SDA) je in vitro tehnika izotermne DNA amplifikacije koja se temelji na enzimskoj reakciji koju je prvi predložio američki znanstvenik Walker 1992. godine.

Osnovni sustav SDA uključuje restrikcijsku endonukleazu, DNA polimerazu s aktivnošću pomicanja lanca, dva para početnica, dNTP-ove i ione kalcija i magnezija te puferske sustave.

Načelo pojačanja premještanja lanca temelji se na kemijski modificiranoj sekvenci prepoznavanja restrikcijske endonukleaze na oba kraja ciljne DNA.Endonukleaza otvara prazninu u lancu DNA na njegovom mjestu prepoznavanja, a DNA polimeraza produžuje prazninu 3′ End i zamjenjuje sljedeći lanac DNA.

Zamijenjene jednostruke niti DNA mogu se kombinirati s početnicama i produžiti u dvostruke niti pomoću DNA polimeraze.Ovaj se proces kontinuirano ponavlja, tako da se ciljna sekvenca učinkovito pojačava.

Tehnologija izotermne amplifikacije nukleinskih kiselina3

Prednosti i nedostaci tehnologije pojačanja pomakom niti

Prednosti SDA:

Učinkovitost pojačanja je visoka, vrijeme reakcije je kratko, specifičnost je jaka i nije potrebna posebna oprema.

Nedostaci SDA:

Produkti nisu jednolični, a neki jednolančani i dvolančani proizvodi uvijek se proizvode u SDA ciklusu, a zaostatak će neizbježno nastati kada se otkrije elektroforezom.

Rpojačanje kruga ollinga

Rolling Circle Amplification (RCA) predlaže se oslanjajući se na metodu kopiranja DNA iz patogenih organizama Rolling Circle.Odnosi se na korištenje jednolančane kružne DNA kao predloška na konstantnoj temperaturi i posebne DNA polimeraze (kao što je Phi29) ) Pod djelovanjem kotrljajućeg kruga sinteze DNA kako bi se postigla amplifikacija ciljnog gena.

RCA se može podijeliti na linearno pojačanje i eksponencijalno pojačanje.Učinkovitost linearnog RCA može doseći 105puta, a učinkovitost eksponencijalnog RCA može doseći 109puta.

Jednostavna razlika, kao što je prikazano na donjoj slici, linearna amplifikacija a koristi samo 1 početnicu, eksponencijalna amplifikacija b ima 2 početnice.

Tehnologija izotermne amplifikacije nukleinskih kiselina4

Linearni RCA se još naziva i pojedinačni primer RCA.Početnica se veže na kružnu DNK i produžuje se djelovanjem DNK polimeraze.Proizvod je linearni jednostruki niz s velikim brojem ponavljajućih nizova koji su tisućama puta duži od jedne petlje.

Budući da je produkt linearnog RCA uvijek spojen na početni primer, jednostavno fiksiranje signala velika je prednost.

Eksponencijalni RCA, također poznat kao hiperrazgranati HRCA (Hyper razgranati RCA), kod eksponencijalnog RCA, jedan primer pojačava produkt RCA, drugi primer hibridizira s produktom RCA i produžuje se, a zamjena je već vezana za produkt RCA.

Tehnologija izotermne amplifikacije nukleinskih kiselina5

Prednosti i nedostaci amplifikacije nukleinske kiseline u krugu

Prednosti RCA:

Visoka osjetljivost, dobra specifičnost i jednostavno rukovanje.

Nedostaci RCA:

Pozadinski problemi tijekom otkrivanja signala.Tijekom RCA reakcije, sonda bez lokota i predložak DNA ili RNA nevezane sonde mogu generirati neke pozadinske signale. 

Namplifikacija temeljena na sekvenci ukleinske kiseline

Amplifikacija temeljena na sekvenci nukleinskih kiselina (NASBA) nova je tehnologija razvijena na temelju PCR-a.To je kontinuirana i izotermna amplifikacija nukleinske kiseline vođena parom početnica s T7 promotorskom sekvencom.Tehnologija može amplificirati predlošku RNA oko 109 puta u oko 2 sata, što je 1000 puta više od konvencionalne PCR metode i ne zahtijeva posebnu opremu.

Ova tehnologija korištena je za brzu dijagnostiku bolesti čim se pojavila, a mnoge tvrtke trenutno koriste ovu metodu u setovima za otkrivanje RNK.

Iako pojačanje RNA također može koristiti PCR tehnologiju reverzne transkripcije, NASBA ima svoje prednosti: može se provoditi pod relativno konstantnim temperaturnim uvjetima, a stabilnija je i preciznija od tradicionalne PCR tehnologije.

Reakcija je na 41 stupnju Celzijusa i zahtijeva reverznu transkriptazu AMV (virus ptičje mijeloblastoze), RNazu H, T7 RNA polimerazu i par početnica da bi se dovršila.

Proces uglavnom uključuje:

Prednja početnica sadrži komplementarnu sekvencu promotora T7.Tijekom reakcije, prednja početnica veže se na RNA lanac i katalizirana je AMV enzimom kako bi se formirao dvostruki lanac DNA-RNA.

RNaza H probavlja RNA u hibridnom dvostrukom lancu i zadržava jednolančanu DNA.

Pod djelovanjem reverzne početnice i enzima AMV nastaje dvostruki lanac DNA koji sadrži sekvencu promotora T7.

Pod djelovanjem T7 RNA polimeraze dovršava se proces transkripcije i stvara se velika količina ciljne RNA.

Tehnologija izotermne amplifikacije nukleinskih kiselina6

Prednosti NASBA:

(1) Njegova početnica ima T7 promotorsku sekvencu, ali strana dvolančana DNA nema T7 promotorsku sekvencu i ne može se pojačati, tako da ova tehnologija ima visoku specifičnost i osjetljivost.

(2) NASBA izravno uključuje proces obrnute transkripcije u reakciju pojačanja, skraćujući vrijeme reakcije.

Nedostaci NASBA:

(1) Komponente reakcije su kompliciranije.

(2) Potrebne su tri vrste enzima da bi se cijena reakcije povećala.


Vrijeme objave: 6. kolovoza 2021