1. Odredite apsorbanciju otopine RNA
Apsorbancija na 280, 320, 230 i 260 nm predstavlja vrijednosti nukleinske kiseline, pozadine (mutnoće otopine), koncentracije soli i organske tvari kao što je protein.Općenito gledajte samo OD260/OD280 (Omjer, R).Kada je 1,8~2,0, mislimo da se kontaminacija proteina ili druge organske tvari u RNA može tolerirati, ali treba napomenuti da kada se Tris koristi kao pufer za otkrivanje apsorbancije, R vrijednost može biti veća od 2 (općenito bi trebala biti <2,2).Kada je R<1,8, onečišćenje bjelančevinama ili drugim organskim tvarima u otopini je očitije, a sudbina RNA može se odrediti prema potrebama.Kada je R>2,2, to znači da je RNK hidrolizirana u jednu nukleinsku kiselinu.
2.Elektroforetski uzorak RNA
Općenito, za elektroforezu RNA koristi se denaturirajući gel, no ako se radi samo o detekciji kvalitete RNA, denaturirajući gel nije potreban, već se može koristiti obični agarozni gel.Svrha elektroforeze je detektirati cjelovitost 28S i 18S vrpci i njihov omjer, odnosno cjelovitost razmaza mRNA.Općenito, ako su trake 28S i 18S svijetle, jasne i oštre (što se odnosi na rubove traka su jasni), a svjetlina 28S je više nego dvostruko veća od svjetline trake 18S, smatramo da je kvaliteta RNK dobra.
Gore su dvije metode koje obično koristimo, ali niti jedna od ove dvije metode nam ne može jasno reći postoji li rezidualna RNaza u otopini RNK.Ako postoji vrlo mala količina RNaze u otopini, teško ju možemo otkriti gornjom metodom, ali većina naknadnih enzimskih reakcija provodi se na iznad 37 stupnjeva i dugo vremena.Na ovaj način, ako postoji vrlo mala količina RNaze u otopini RNA, tada će postojati vrlo pogodno okruženje i vrijeme da igraju svoju ulogu u narednim eksperimentima, a naravno da će eksperiment u ovom trenutku biti hladan.U nastavku predstavljamo metodu koja može potvrditi postoji li rezidualna RNaza u otopini RNA.
3. Ispitivanje očuvanja topline
U skladu s koncentracijom uzorka, izvucite dvije RNA od 1000 ng iz otopine RNA i dodajte je u epruvetu za centrifugiranje od 0,5 ml i dopunite ju pH 7,0 Tris puferom do ukupnog volumena od 10 ul, a zatim zatvorite čep epruvete.Jedan od njih stavite u vodenu kupelj stalne temperature na 70°C i držite na toplom 1 sat.Drugi dio je pohranjen u hladnjaku na -20°C 1 h.Kada vrijeme istekne, izvadite dva uzorka za elektroforezu.Nakon što je elektroforeza završena, usporedite elektroforetske vrpce ta dva.Ako su vrpce ove dvije konzistentne ili nemaju značajne razlike (naravno, njihove vrpce također zadovoljavaju uvjete u metodi 2), to znači da nema zaostale kontaminacije RNazom u otopini RNA, a kvaliteta RNA je vrlo dobra.Naprotiv, ako uzorak inkubiran na 70°C pokazuje očitu degradaciju, to znači da postoji kontaminacija RNazom u otopini RNK.
2. Eksperimentalne metode i tehnike ekstrakcije RNA
Problemi s kojima se često susrećemo pri ekstrakciji RNA su: (1) prinos RNA je nizak;(2) RNA ima ozbiljno zagađenje soli;(3) RNA ima ozbiljno onečišćenje organskim otapalima;(4) degradacija uzorka i drugi problemi
1. Često korišteni reagensi za ekstrakciju ukupne RNA
Metoda gvanidin izotiocijanata i metoda Trizol najčešće su korištene metode za ekstrakciju ukupne RNK iz životinjskih tkiva i životinjskih stanica.Posebno je prikladan za male uzorke i tkiva koja je posebno teško ekstrahirati, kao što je ekstrakcija ukupne RNK iz kože kunića i životinjskog vezivnog tkiva;osim toga, Trizol, kao reagens za lizu opće namjene, također se može koristiti za ekstrakciju biljnih tkiva, bakterija, gljivica i drugih tkiva.Za biljna tkiva koja sadrže polisaharide i polifenole, kao što su kamelija oleifera, listovi čaja, sjemenke uljane repice itd., CTAB metoda se također može koristiti za ekstrakciju ukupne RNK.
Kao konvencionalna metoda, metoda dvostruke kolone također je vrlo popularna zbog rada na normalnoj temperaturi, nema potrebe za dodavanjem RNaze i sigurnosti—bez kloroforma, fenola i drugih organskih reagensa za ekstrakciju.(preporučeni proizvodi )
2. Ekstrakcija ukupne RNA iz životinjskih tkiva
(1) Pokušajte odabrati svježe tkivo, ako nije svježe (po mogućnosti unutar tri mjeseca - u hladnjaku na 80 ℃ ili zamrznuto u tekućem dušiku. Prilikom rezanja tkiva, nemojte rezati izravno na sobnoj temperaturi, svakako ga stavite u kutiju za led, pokušajte izbjeći ponovno zamrzavanje i odmrzavanje.
(2) Čistim škarama i pincetom izrežite mali komad tkiva, pokušajte odrezati središnji dio tkiva prilikom rezanja uzorka ili prvo izrežite veliki komad tkiva od sredine, a zatim izrežite uzorak na mjestu svježeg reza.Uklonjeno tkivo treba u potpunosti usitniti, isjeckano tkivo staviti u EP epruvetu bez RNaze, dodati lizat, isjeckano tkivo treba u potpunosti izložiti lizatu i pripremiti za homogenizaciju.
(3) Za normalna tkiva odaberite tkiva veličine mung graha (30-60 mg) za homogenizaciju.Ako tkiva sadrže veliku količinu proteina, masti ili gustih vlaknastih tkiva kao što je jetra, odgovarajuće povećajte ili smanjite količinu izrezanih tkiva (po izboru) Odaberite 10~20 mg).
(4) Ako se ekstrahiraju mišići ribe, meso račića, meduza i druga tkiva s visokim udjelom vode, potrebno je primjereno povećati volumen uzorka (preporučeno 100-200 mg).
(5) Ako to uvjeti dopuštaju, životinjsko tkivo može se izravno ekstrahirati nakon homogeniziranja visokopropusnim homogenizatorom tkiva, ako takva oprema ne postoji.
(6) RNA dobivena nakon završne ekstrakcije mora se odmah staviti u kutiju za led kako bi se smanjila razgradnja RNA.
3. Ekstrakcija RNK životinjskih stanica
(1) Stanice u suspenziji: centrifugirajte izravno i bacite medij, isperite sterilnim PBS-om 1-2 puta, zatim suspendirajte s odgovarajućom količinom PBS-a, a zatim dodajte lizat za lizu.Nemojte dodavati lizat izravno u istaložene stanice nakon potpunog odbacivanja tekućine.To će uzrokovati da se paket histona oslobođen nakon liziranih stanica na vanjskom sloju prilijepi za vanjsku stranu istaloženih stanica, čime se ograničava kontakt stanica unutar peleta s lizatom., što dovodi do nepotpune stanične lize i smanjenog prinosa RNA.
(2) Stanice koje su polu-adherentne ili nisu čvrsto adhezirane: Nakon bacanja medija, isperite PBS-om 1-2 puta, zatim izravno apsorbirajte odgovarajuću količinu PBS-a i otpuhnite posudu s kulturom pipetom ili pištoljem kako biste otpuhali stanice i prenijeli ih u stanice bez RNA.Dodajte lizat u EP epruvetu enzima za ekstrakciju.
(3) Prilijepljene stanice: prvo ih je potrebno probaviti s tripsinom, zatim sakupiti u EP epruvete bez RNaze, centrifugirati kako bi se uklonio supernatant, isprati 1-2 puta s PBS-om kako bi se uklonio višak tripsina i resuspendirati s odgovarajućom količinom PBS-a. Zatim prijeđite na korak ekstrakcije.
4. Ekstrakcija biljne RNA
Biljna tkiva su bogata fenolnim spojevima, ili bogata polisaharidima, ili sadrže neke neidentificirane sekundarne metabolite, ili imaju visoku aktivnost RNaze.Te su tvari čvrsto spojene s RNA nakon stanične lize i tvore netopljive komplekse ili koloidne precipitate, koje je teško ukloniti.Stoga, kada ekstrahiramo biljno tkivo, moramo odabrati komplet za biljke.Lizat u kompletu može učinkovito riješiti probleme lake oksidacije polifenola i odvajanja polisaharidnih spojeva i nukleinskih kiselina.
(Za ekstrakciju polisaharida polifenola biljne RNA, preporučeni proizvodi:
(1) Koru, pulpu, sjemenke, lišće itd. biljke treba potpuno samljeti u mužaru.Tijekom procesa mljevenja tekući dušik treba na vrijeme dopuniti kako bi se izbjeglo topljenje uzorka.Samljeveni uzorak treba brzo dodati lizatu i protresti kako bi se izbjegla degradacija RNK.
(2) Za uzorke bogate vlaknima kao što su lišće riže i pšenice, količinu ekstrakcije treba odgovarajuće smanjiti, inače mljevenje tkiva i liza neće biti dovršeni, što će rezultirati niskim prinosom ekstrahirane RNA.
(3) Za biljna tkiva s visokim sadržajem vode, kao što su plod nara, plod lubenice, plod breskve itd., veličinu uzorka treba odgovarajuće povećati (100-200 mg nije obavezno).
(4) Za biljna tkiva, kao što su lišće biljke, rizomi, tvrdi plodovi i drugi materijali općenito se preporučuje korištenje tekućeg dušika za temeljito malterisanje sastojaka u mortu, a zatim prijeđite na korak ekstrakcije.Konvencionalni homogenizatori tkiva možda neće biti učinkoviti u homogenizaciji biljnih tkiva i općenito se ne preporučuju.
5. Mjere opreza za ekstrakciju RNA
(1) Uzorci tkiva trebaju biti što svježiji kako bi se izbjeglo ponovno smrzavanje i odmrzavanje.
(2) Tkivo tijekom ekstrakcije treba biti potpuno samljeveno, a količina tkiva ne smije biti premala, a kamoli prevelika.
(3) Potrebno je dati dovoljno vremena inkubacije nakon dodavanja lizata da se uzorak potpuno lizira.
(4) Kada se koristi Trizol metoda za ekstrakciju, načelo apsorpcije supernatanta nakon stratifikacije je "radije udisati manje nego udahnuti više", i ne smije se ekstrahirati do srednjeg sloja, inače će izazvati ozbiljnu kontaminaciju genomske DNA.
(5) Prilikom pranja, tekućina za pranje trebala bi se potpuno infiltrirati oko stijenke cijevi kako bi se osiguralo temeljito pranje.
(6) Za metodu ekstrakcije kolone, osim odvajanja kolone nakon pranja, adsorpcijsku kolonu također treba staviti u ultra-čistu klupu i puhati 5-10 minuta kako bi organsko otapalo potpuno isparilo do suhog.
(7) Pri posljednjem eluiranju kolonske metode, nakon dodavanja DEPC vode, treba ga inkubirati 3-5 minuta ili DEPC vodu treba unaprijed zagrijati na 60°C kako bi se povećao prinos elucije.U tradicionalnoj metodi Trizol cijepanja i taloženja izopropanolom, konačna RNA se otapa u DEPC vodi, stoga treba dati odgovarajuće vrijeme za otapanje, a dno centrifugalne epruvete treba kontinuirano puhati vrhom pipete.
3 Three Uzroci i rješenja za nisku koncentraciju RNA/lošu kvalitetu
1. Prinos je prenizak
Ekstrahirani uzorak je premali, ukupna količina je nedovoljna ili je ekstrahirani uzorak previše i liza nije dovršena;tkivo ili stanice odgovarajuće kvalitete trebaju se koristiti za ekstrakciju, prethodna obrada uzorka mora biti dobro obavljena, a liza mora biti dostatna.
2. Ostaci genoma
Kod ekstrakcije Trizol metodom, kada se supernatant usisava u srednji sloj nakon naslojavanja, doći će do ozbiljne kontaminacije genoma;potrebno je posebno paziti prilikom nanošenja slojeva kako bi se izbjeglo usisavanje srednjeg sloja.Ako se za ekstrakciju koristi kolonska metoda, za ekstrakciju se može odabrati kit koji sadrži DNazu I.Nukleinska kiselina adsorbirana na membrani izravno se probavlja s DNazom I, što može uvelike smanjiti ostatke DNA.
3. Degradacija RNK
To može biti degradacija samog ekstrahiranog uzorka ili degradacija uzrokovana tijekom procesa ekstrakcije;koliko god je to moguće, svježe uzorke treba koristiti za ekstrakciju RNA, a prikupljene uzorke treba na vrijeme pohraniti u hladnjak na tekući dušik ili -80°C, te treba izbjegavati ponovno zamrzavanje i odmrzavanje.U procesu ekstrakcije RNK trebali bi se koristiti vrhovi bez RNaze/DNase, epruvete za centrifugiranje i drugi materijali.Proces ekstrakcije treba biti što brži.Ekstrahiranu RNA treba staviti u kutiju za led i pohraniti na -80 na vrijeme.Ako je ekstrahiranu RNA potrebno detektirati elektroforezom u gelu, elektroforezu je potrebno provesti odmah nakon ekstrakcije, a pufer za elektroforezu zamijeniti novopripremljenim.
4. Ostaci soli i organskih otapala
Reagensi za ekstrakciju sadrže fenol i soli gvanidina, a otopina za pranje sadrži etanol.Tijekom procesa ekstrakcije, lizat nije potpuno apsorbiran i odbačen, a otopina za pranje nije bila potpuno osušena.Zaostale soli i organska otapala štetni su za naknadnu reverznu transkripciju i PCR.Različiti stupnjevi inhibicije, tako da lizat tkiva treba biti potpuno uklonjen tijekom procesa ekstrakcije, a pranje treba biti dovoljno da se okolne stijenke cijevi mogu oprati.Osim toga, cijev se isprazni i propuhuje nužan korak, što će dodatno smanjiti ostatke organske tvari.
Za više informacija o ekstrakciji RNA, pratite našu web stranicu:
www.foreivd.com za više informacija.
Vrijeme objave: 1. prosinca 2022
