• facebook
  • linkedin
  • youtube

 Fluorescencijski kvantitativni PCR (također poznat kao TaqMan PCR, u daljnjem tekstu FQ-PCR) nova je kvantitativna tehnologija nukleinske kiseline koju je razvio PE (Perkin Elmer) u Sjedinjenim Državama 1995. Ova se tehnologija temelji na konvencionalnom PCR-u dodavanjem fluorescentno obilježenih sondi.U usporedbi s fleksibilnim PCR-om, FQ-PCR ima mnoge prednosti za realizaciju svoje kvantitativne funkcije.Ovaj članak namjerava ukratko opisati karakteristike, principe, metode i primjene tehnologije.

1 Značajke

FQ-PCR ne samo da ima visoku osjetljivost običnog PCR-a, već također zbog primjene fluorescentnih sondi može izravno detektirati promjenu fluorescentnog signala tijekom PCR pojačanja kroz fotoelektrični provodni sustav za dobivanje kvantitativnih rezultata, čime se prevladavaju mnogi nedostaci konvencionalnog PCR-a, tako da također ima visoku specifičnost DNA hibridizacije i visoku točnost tehnologije spektroskopije.

Na primjer, opće PCR proizvode potrebno je promatrati elektroforezom u agaroznom gelu i bojanjem etidijevim bromidom ultraljubičastim svjetlom ili elektroforezom u poliakrilamidnom gelu i bojenjem srebrom.To ne samo da zahtijeva više instrumenata, već zahtijeva i vrijeme i trud.Korištene mrlje Etidijev bromid je štetan za ljudsko tijelo, a ovi komplicirani eksperimentalni postupci pružaju mogućnosti za onečišćenje i lažno pozitivne rezultate.Međutim, FQ-PCR treba otvoriti poklopac samo jednom tijekom punjenja uzorka, a kasniji proces je potpuno zatvorena epruveta, koja ne zahtijeva PCR naknadnu obradu, čime se izbjegavaju mnogi nedostaci u konvencionalnim PCR operacijama.Eksperiment općenito koristi termalni cikler ABI7100 PCR koji je razvila tvrtka PE.

Instrument ima sljedeće karakteristike: ① Široka primjena: Može se koristiti za kvantifikaciju proizvoda DNA i RNA PCR, istraživanje ekspresije gena, detekciju patogena i optimizaciju uvjeta PCR.② Jedinstveno kvantitativno načelo: korištenjem fluorescentno obilježenih sondi, količina fluorescencije će se akumulirati s PCR ciklusom nakon laserske ekscitacije, kako bi se postigla svrha kvantifikacije.③ Visoka radna učinkovitost: Ugrađeni 9600 PCR termalni cikler, računalno kontroliran 1 do 2 sata za dovršetak amplifikacije i kvantifikacije 96 uzoraka automatski i sinkrono.④ Nema potrebe za gel elektroforezom: Nema potrebe za razrjeđivanjem i elektroforezom uzorka, samo koristite posebnu sondu za detekciju izravno u reakcijskoj cijevi.⑤Nema zagađenja u cjevovodu: usvojena je jedinstvena potpuno zatvorena reakcijska cijev i sustav fotoelektrične vodljivosti, tako da nema potrebe brinuti o zagađenju.⑥Rezultati su ponovljivi: kvantitativni dinamički raspon je do pet reda veličine.Stoga, budući da je ova tehnologija uspješno razvijena, cijenjena je od strane mnogih znanstvenih istraživača i primijenjena je u mnogim područjima.

2 Principi i metode

Princip rada FQ-PCR-a je korištenje 5′→3′ egzonukleazne aktivnosti enzima Taq za dodavanje fluorescentno obilježene sonde u PCR reakcijski sustav.Sonda se može specifično hibridizirati s DNK šablonom sadržanom u nizu početnica.5′ kraj sonde označen je genom za emisiju fluorescencije FAM (6-karboksifluorescein, vrhunac emisije fluorescencije na 518 nm), a 3′ kraj je označen grupom za gašenje fluorescencije TAMRA (6-karboksitetrametilrodamin, vrhunac emisije fluorescencije na 582 nm), 3′ početak sonde je fosforiliran kako bi se spriječilo produljenje sonde tijekom PCR amplifikacije.Kada sonda ostane netaknuta, skupina za gašenje potiskuje emisiju fluorescencije emitirajuće skupine.Nakon što se emitirajuća skupina odvoji od skupine za gašenje, inhibicija se ukida, a optička gustoća na 518 nm raste i detektira je sustav za detekciju fluorescencije. U fazi renaturacije, sonda se hibridizira s predloškom DNA, a enzim Taq u fazi ekstenzije kreće se duž DNK predloška s produžetkom početnice.Kada se sonda prekine, oslobađa se učinak gašenja i oslobađa se fluorescentni signal.Svaki put kad se predložak kopira, sonda se odsiječe, uz oslobađanje fluorescentnog signala.Budući da postoji odnos jedan-na-jedan između broja oslobođenih fluorofora i broja PCR produkata, ova se tehnika može koristiti za točno kvantificiranje uzorka.Eksperimentalni instrument općenito koristi termalni cikler ABI7100 PCR koji je razvila tvrtka PE, a mogu se koristiti i drugi termocikleri.Ako se za eksperiment koristi reakcijski sustav tipa ABI7700, nakon završetka reakcije, kvantitativni rezultati mogu se izravno dati pomoću računalne analize.Ako koristite druge termociklere, trebate koristiti detektor fluorescencije za mjerenje signala fluorescencije u reakcijskoj cijevi u isto vrijeme za izračunavanje RQ+, RQ-, △RQ.RQ+ predstavlja omjer intenziteta luminescencije skupine fluorescentne emisije epruvete s uzorkom prema intenzitetu luminescencije skupine za gašenje, RQ- predstavlja omjer to dvoje u praznoj epruveti, △RQ (△RQ=RQ+-RQ-) predstavlja količinu promjene fluorescentnog signala tijekom PCR-a. Nakon obrade podataka mogu se dobiti kvantitativni rezultati.Uvođenjem fluorescentnih sondi značajno je poboljšana specifičnost pokusa.Dizajn sonde općenito bi trebao ispunjavati sljedeće uvjete: ①Duljina sonde trebala bi biti oko 20-40 baza kako bi se osigurala specifičnost vezanja.②Sadržaj GC baza je između 40% i 60% kako bi se izbjeglo dupliciranje pojedinačnih nukleotidnih sekvenci.③ Izbjegavajte hibridizaciju ili preklapanje s primerima.④ Stabilnost vezanja između sonde i predloška veća je od stabilnosti vezanja između primera i predloška, ​​tako da vrijednost Tm sonde treba biti najmanje 5°C viša od vrijednosti Tm primera.Osim toga, koncentracija sonde, homologija između sonde i predloška sekvence i udaljenost između sonde i početnice imaju utjecaj na eksperimentalne rezultate.

Povezani proizvodi:

Kina Lnc-RT Heroᵀᴹ I (s gDNase) (super premiks za sintezu prvog lanca cDNA iz lncRNA) Proizvođač i dobavljač |Foregene (foreivd.com)

Kina PCR u stvarnom vremenu Easyᵀᴹ-Taqman Proizvođač i dobavljač |Foregene (foreivd.com)


Vrijeme objave: 15. listopada 2021