• facebook
  • linkedin
  • youtube

Izvanredna značajka PCR reakcije je veliki kapacitet amplifikacije i iznimno visoka osjetljivost.Kako bismo poboljšali performanse PCR-a i učinkovitost detekcije, predani smo poboljšanju kapaciteta PCR pojačanja i osjetljivosti detekcije, ali glavobolja je u procesu eksperimenta.Često se javljaju lažno pozitivni rezultati, a vrlo mala količina unakrsne kontaminacije uzorka ili PCR proizvoda može uzrokovati lažno pozitivne rezultate u eksperimentu.

Pet vrsta kontaminacije PCR produkta

Postoji mnogo razloga za PCR kontaminaciju, koji se mogu grubo podijeliti u sljedeće kategorije:

1. Unakrsna kontaminacija između uzoraka

1.1

Kontaminacija uzorka uglavnom je uzrokovana kontaminacijom spremnika za prikupljanje uzorka, ili kada se uzorak stavi, iscuri iz spremnika zbog labavog brtvljenja ili se uzorak zalijepi za vanjsku stranu spremnika, što uzrokuje unakrsnu kontaminaciju;Kontaminacija dovodi do kontaminacije između uzoraka;neki mikrobni uzorci, osobito virusi, mogu se širiti aerosolima ili stvarati aerosole, što dovodi do međusobne kontaminacije.

2. Kontaminacija PCR reagensa

Glavni razlog je taj što su tijekom pripreme PCR reagensa pištolj za uzorke, spremnik, dvostruko destilirana voda i druge otopine kontaminirani PCR nukleinsko kiselinskim šablonom.

1.2

3.Kontaminacija plazmidom kloniranja

1.3

U laboratorijima molekularne biologije i nekim laboratorijima koji koriste klonirane plazmide kao pozitivne kontrole, problem kontaminacije kloniranim plazmidima također je čest.Budući da je sadržaj plazmida za kloniranje u jedinici volumena prilično visok, a potrebno je više alata i reagensa u procesu pročišćavanja, a plazmid u živim stanicama vrlo je vjerojatno da će biti kontaminiran zbog snažnog rasta i sposobnosti reprodukcije živih stanica.

4.Kontaminacija pojačanih proizvoda

Kontaminacija umnoženih proizvoda je najčešći problem kontaminacije u PCR reakcijama.Budući da je količina kopija PCR produkta velika (općenito 1013 kopija/ml), što je daleko više od granice broja kopija za PCR detekciju, vrlo mala količina kontaminacije PCR produktom može uzrokovati lažno pozitivne rezultate.

1.4

5.Onečišćenje aerosolom

1.5

Onečišćenje aerosolom najvjerojatniji je oblik kontaminacije PCR proizvoda, a ujedno ga je i najlakše previdjeti.Nastaje trenjem između površine tekućine i zraka.Općenito, kontaminacija aerosolom može nastati kada se poklopac otvori, kada se uzorak usisava ili čak kada se reakcijska epruveta snažno protrese.Prema izračunima, čestica aerosola može sadržavati 48.000 kopija, pa je zagađenje koje ona uzrokuje problem koji zaslužuje posebnu pozornost.

Konkretno, laboratoriji za testiranje često koriste isti par početnica za testiranje određenog gena.S vremenom će se u laboratorijskom prostoru pojaviti velika količina kontaminacije PCR produkta.Jednom kada se takva kontaminacija dogodi, teško ju je ukloniti u kratkom vremenu.

Za prve tri vrste onečišćenja možemo upotrijebiti učinkovita sredstva za izbjegavanje, ali je onečišćenje uzrokovano PCR proizvodima teško spriječiti, posebno u izgradnji nestandardnih PCR laboratorija.U procesu PCR, kada vrh pipete usisava i upuhuje tekućinu, a poklopac PCR cijevi se otvori, formirat će se aerosol.Molekule DNK koje nosi aerosol (jedan aerosol može nositi desetke tisuća DNK) teško je eliminirati jer lebde u zraku.Nakon što se uvede sljedeći krug PCR eksperimenata, neizbježno će se dogoditi lažno pozitivni rezultati.

Kao što je prikazano na donjoj slici, negativna kontrola također je pojačala odgovarajući pojas od interesa:

1.6

Ovdje je predstavljen prvi dio ovog pitanja PCR onečišćenja i prevencije.Sljedeći broj donosi vam drugi dio "Sprečavanje kontaminacije PCR produkta", stoga nas pratite!


Vrijeme objave: 25. srpnja 2017