Provjera učinkovitosti početnica i sondi u ranoj fazi PCR reagensa i određivanje najprikladnijih reakcijskih uvjeta preduvjeti su za osiguranje glatkog napredovanja formalnih eksperimenata.
Dakle, kako trebamo potvrditi početnu sondu u ranoj fazi?
Glavni pokazatelji su osnovna linija, krivulja pojačanja, ct vrijednost, učinkovitost pojačanja, detekcija uzorka niske koncentracije, CV, itd.
Osnovna linija
Osnovna linija je vodoravna linija u PCR krivulji amplifikacije.U prvih nekoliko ciklusa PCR reakcije pojačanja, fluorescencijski signal se ne mijenja mnogo i oblikuje ravnu liniju.Ova ravna linija je osnovna linija.
Prilikom pregledavanja PCR početnih sondi, obratite pozornost na to je li osnovna linija na razini.Čistoća koncentracije probe prajmera utjecat će na osnovnu liniju, na primjer uzrokujući porast ili pad osnovne linije.Osnovna linija također je vrlo intuitivan pokazatelj.
Krivulja pojačanja
Drugi intuitivni pokazatelj je oblik krivulje pojačanja.Najbolje je imati krivulju u obliku slova S kako bi se izbjeglo sekundarno pojačanje ili druge abnormalne krivulje pojačanja.
Ct vrijednost
Broj ciklusa koji odgovara točki infleksije od osnovne linije do eksponencijalnog rasta je vrijednost Ct.
Za isti uzorak, različite primer sonde rezultiraju različitim krivuljama pojačanja, a na odgovarajuću vrijednost Ct utjecat će učinkovitost pojačanja i stupanj interferencije.U teoriji, što je manja Ct vrijednost sonde početnika koju odaberemo, to bolje.
Učinkovitost pojačanja
Jedna od najpouzdanijih i najstabilnijih metoda za procjenu učinkovitosti PCR amplifikacije je standardna krivulja, koju također naširoko priznaju istraživači.Metoda uključuje izradu niza uzoraka za kontrolu relativnog broja ciljnih predložaka.Ti se uzorci obično izrađuju serijskim razrjeđivanjem koncentrirane osnovne otopine, a najčešće se koristi 10-struko razrjeđenje.Korištenje niza razrijeđenih uzoraka, korištenje standardnog qPCR programa za amplificiranje kako bi se dobila vrijednost Cq, i na kraju nacrtati standardnu krivulju prema koncentraciji svakog uzorka i odgovarajućoj Cq vrijednosti kako bi se dobila linearna jednadžba Cq= -klgX0+b, i učinkovitost amplifikacije E=10(-1 /k)-1.Kada se koristi qPCR za kvantitativnu analizu, učinkovitost pojačanja mora biti u rasponu od 90%-110% (3,6>k>3,1).
Detekcija uzoraka niske koncentracije
Kada je koncentracija uzorka niska, stope detekcije različitih početnih sondi su različite.Odabiremo 20 uzoraka niske koncentracije za replikaciju, a sustav primer-sonda s najvećom stopom detekcije je najbolji.
Koeficijent varijacije (CV)
10 dvostrukih uzoraka može se detektirati s različitim početnim probama prema liniji standarda reagensa za detekciju amplifikacije nukleinske kiseline.
Kvantitativni reagensi:
Točnost
Točnost unutar jedne serije treba zadovoljiti: koeficijent varijacije (CV,%) logaritamske vrijednosti ispitne koncentracije je ≤5%.Kada je koncentracija uzorka niska, koeficijent varijacije (CV,%) logaritma koncentracije detekcije je ≤10%
Kvalitativni reagensi:
Točnost
Točnost unutar jedne serije treba zadovoljiti:
(1) Koeficijent varijacije Ct vrijednosti (CV,%) ≤5%
Isti se uzorak ispituje paralelno 10 puta, a rezultati ispitivanja moraju biti dosljedni
Vrijeme objave: 18. rujna 2021
