• facebook
  • linkedin
  • youtube

U ranoj fazi izbijanja, zbog brzog razvoja, brza dijagnoza sumnjivih pacijenata ključ je za prevenciju COVID-19.Neki odobreni reagensi za detekciju nukleinskih kiselina imaju kratko vrijeme razvoja i postoje problemi kao što su žurna potvrda performansi, nedovoljna optimizacija reagensa i velike razlike između serija;Problemi različitih kliničkih laboratorija u različitim aspektima procesa detekcije nukleinske kiseline također mogu utjecati na točnost rezultata detekcije nukleinske kiseline.Ovaj će se članak usredotočiti na ključne poveznice i točke u trenutnoj detekciji nukleinske kiseline SARS-CoV-2 i analizirati probleme lažno negativnih i pozitivnih ponovnih ispitivanja laboratorijske detekcije nukleinske kiseline i kliničku nedosljednost.

Principi detekcije nukleinske kiseline SARS-CoV-2

SARS-CoV-2 je RNA virus sa sekvencom genoma od oko 29 kb, s 10 gena, koji može učinkovito kodirati 10 proteina.Virusi se sastoje od RNK i proteina, a krajnji vanjski sloj je vanjski omotač sastavljen od lipida i glikoproteina.Unutra, proteinski kapsid obavija RNA u sebi, štiteći tako lako razgradivu RNA (P1).

zfgd

P1 Struktura SARS-COV-2

Virusi napadaju stanice preko specifičnih receptora na staničnoj površini kako bi izazvali infekciju i koriste stanice domaćina za replikaciju.

Načelo detekcije virusne nukleinske kiseline je izlaganje virusne RNK kroz stanični lizat, a zatim korištenje lančane reakcije fluorescentne reverzne transkripcije polimeraze (RT-PCR) u stvarnom vremenu za detekciju.

Ključ principa detekcije je korištenje početnica i sondi za postizanje "ciljanog podudaranja" sekvenci nukleinske kiseline, odnosno pronalaženje sekvence nukleinske kiseline SARS-CoV-2 koja se razlikuje od drugih virusa u oko 30 000 baza (sličnost nukleinske kiseline s drugim virusima) "Nisko" područje), dizajn početnica i sondi.

Prajmeri i sonde se visoko podudaraju sa specifičnom regijom nukleinske kiseline SARS-CoV-2, odnosno specifičnost je vrlo jaka.Kada rezultat fluorescentne RT-PCR amplifikacije u stvarnom vremenu uzorka koji se testira bude pozitivan, to dokazuje da je SARS-CoV-2 prisutan u uzorku.Vidi P2.

zfgd2

P2 Koraci određivanja nukleinske kiseline SARS-CoV-2 (fluorescentna RT-PCR u stvarnom vremenu)

Uvjeti i zahtjevi laboratorija za detekciju nukleinske kiseline SARS-CoV-2

Laboratoriji za testiranje nukleinskih kiselina najidealniji su za okruženja s negativnim tlakom i trebali bi obratiti pozornost na praćenje tlaka, održavati strujanje zraka i eliminirati aerosole.Osoblje za testiranje nukleinskih kiselina mora imati odgovarajuće kvalifikacije, proći odgovarajuću obuku za lančanu reakciju polimerazom i proći ocjenu.Laboratorij treba biti pod strogim nadzorom, raspoređen na zone, a nevažnom osoblju strogo je zabranjen ulaz.Čisti prostor treba prozračiti i dezinficirati na mjestu.Relevantni predmeti raspoređeni su po zonama, čisti i prljavi su odvojeni, zamijenjeni na vrijeme i dekontaminirani na mjestu.Rutinska dezinfekcija: Dezinfekcijsko sredstvo koje sadrži klor glavno je rješenje za veće površine, a za male površine može se koristiti 75% alkohol.Dobar način rješavanja aerosola je otvaranje prozora radi prozračivanja, a dezinfekciju zraka moguće je provesti i ultraljubičastim zrakama, filtracijom i dezinfekcijom zraka.

Ključne poveznice i parametri određivanja SARS-CoV-2 nukleinske kiseline (real-time fluorescentna RT-PCR)

Iako laboratoriji općenito posvećuju veliku pozornost "otkrivanju" nukleinske kiseline, zapravo je "ekstrakcija" nukleinske kiseline također jedan od ključnih koraka za uspješno otkrivanje, što je usko povezano s prikupljanjem i pohranjivanjem uzoraka virusa.

Trenutačno najčešće korišteni respiratorni uzorci, poput nazofaringealnih briseva, koriste drugu metodu, a to je otopina za inaktivaciju (prezerviranje) pripremljena na temelju ekstrakcije nukleinske kiseline i otopine za lizu.S jedne strane, ovo rješenje za očuvanje virusa može denaturirati protein virusa, izgubiti svoju aktivnost i više ne biti zarazan, te poboljšati sigurnost transporta i faze detekcije;s druge strane, može izravno razbiti virus kako bi oslobodio nukleinsku kiselinu, eliminirao enzim koji razgrađuje nukleinsku kiselinu i spriječio virus.RNK se razgrađuje.

Otopina za uzorkovanje virusa pripremljena na temelju otopine za lizu ekstrakcijom nukleinske kiseline.The main components are balanced salts, ethylenediaminetetraacetic acid chelating agent, guanidine salt (guanidine isothiocyanate, guanidine hydrochloride, etc.), anionic surfactant (dodecane) Sodium sulfate), cationic surfactant (tetradecyl trimethyl ammonium oxalate), phenol, 8-hydroxyquinoline, dithiothreitol, proteinase K and other several or more components.Trenutačno postoje mnoge vrste kompleta za ekstrakciju nukleinske kiseline, a koriste se različiti reagensi za ekstrakciju i pročišćavanje nukleinske kiseline.Čak i ako se koristi isti reagens za ekstrakciju nukleinske kiseline i pročišćavanje, postupci ekstrakcije svakog kompleta su različiti.

Trenutno se proizvodi kompleta za otkrivanje nukleinske kiseline koje je odobrila Nacionalna uprava za medicinske proizvode biraju na temelju gena ORF1ab, E i N u genomu SARS-CoV-2.Načela detekcije različitih proizvoda u osnovi su ista, ali njihovi primeri i dizajni sondi su različiti.Postoje segmenti s jednim ciljem (ORF1ab), segmenti s dva cilja (ORF1ab, N ili E) i segmenti s tri cilja (ORF1ab, N i E).Razlika između otkrivanja i tumačenja, ekstrakcije nukleinske kiseline i fluorescentnog RT-PCR reakcijskog sustava u stvarnom vremenu treba se odnositi na relevantne upute za komplet, a preporučuje se da korisnici strogo slijede metodu tumačenja navedenu u uputama za komplet za tumačenje.Uobičajene regije, početnice i sekvence sonde pojačane fluorescentnom RT-PCR-om u stvarnom vremenu prikazane su u P3.

zfgd3

P3 Lokacija mete umnoška SARS-CoV-2 na genomu i slijed početnica i sondi

Tumačenje rezultata određivanja nukleinske kiseline SARS-CoV-2 (Real-Time fluorescentne RT-PCR)

“Plan prevencije i kontrole upale pluća za infekciju SARS-CoV-2 (drugo izdanje)” po prvi je put pojasnio kriterije za procjenu rezultata amplifikacije jednog gena:

1. Nema Ct ili Ct≥40 nije negativan;

2. Ct<37 je pozitivan;

3. Vrijednost Ct od 37-40 je sivo područje.Preporuča se ponoviti pokus.Ako rezultat ponavljanja Ct<40 i krivulja pojačanja ima očite vrhove, uzorak se smatra pozitivnim, u protivnom je negativan."

Treće izdanje vodiča i četvrto izdanje vodiča nastavili su gore navedene kriterije.Međutim, zbog različitih meta koje se koriste u komercijalnim setovima, prethodno spomenuto 3. izdanje vodiča nije dalo kriterije za određivanje kombinacije meta, naglašavajući da će prevladati upute proizvođača.Počevši od petog izdanja smjernica, razjašnjena su dva cilja, posebno kriteriji prosudbe za jedan cilj koji je teško procijeniti.Odnosno, ako laboratorij želi potvrditi da je slučaj pozitivan na detekciju nukleinske kiseline SARS-CoV-2, potrebno je ispuniti 1 od 2 uvjeta u nastavku:

(1) Dvije mete SARS-CoV-2 (ORF1ab, N) u istom uzorku testirane su pozitivno fluorescentnom RT-PCR-om u stvarnom vremenu.Ako je jedna meta pozitivna, potrebno je ponovno uzorkovanje i ponovno testiranje.Ako su rezultati testa Ako je pojedinačna meta još uvijek pozitivna, ocjenjuje se pozitivnom.

(2) Dva uzorka fluorescentnog RT-PCR-a u stvarnom vremenu pokazala su pozitivan rezultat jednog cilja u isto vrijeme ili su dva uzorka iste vrste pokazala pozitivan rezultat testa jednog cilja, što se može ocijeniti pozitivnim.Međutim, smjernice također naglašavaju da negativni rezultati testiranja nukleinske kiseline ne mogu isključiti infekciju SARS-CoV-2.Potrebno je isključiti čimbenike koji mogu uzrokovati lažno negativne rezultate, uključujući lošu kvalitetu uzorka (respiratorni uzorci iz orofarinksa i drugih dijelova), prerano ili prekasno prikupljanje uzoraka, uzorci nisu pravilno pohranjeni, transportirani i obrađeni, a sama tehnologija je imala problema (varijacije virusa, PCR inhibicija), itd.

Uzroci lažno negativnih rezultata u detekciji SARS-CoV-2

Koncept "lažno negativnog" u testiranju nukleinske kiseline koji se trenutno razmatra često se odnosi na "lažno negativan" u kojem rezultati testa nukleinske kiseline nisu u skladu s kliničkim manifestacijama, to jest, klinički simptomi i rezultati snimanja su vrlo sumnjivi na COVID-19, ali testovi nukleinske kiseline uvijek su "negativni" mnogo puta.Klinički laboratorijski centar Nacionalne zdravstvene komisije objasnio je "lažno negativan" test na SARS-CoV-2.

(1) Postoji određena količina virusa u stanicama zaražene osobe.Postojeći podaci pokazuju da nakon što je tijelo zaraženo virusom, virus kroz nos i usta ulazi u grlo, zatim u dušnik i bronhije, a zatim dospijeva u alveole.Zaražena osoba doživjet će razdoblje inkubacije, blage simptome, a zatim proces teških simptoma i različite faze bolesti.I količina virusa prisutna u različitim dijelovima tijela je različita.

Što se tiče virusnog opterećenja tipova stanica, alveolarne epitelne stanice (donji respiratorni trakt)> epitelne stanice dišnih putova (gornji dišni trakt)> fibroblasti, endotelne stanice i makrofagi, itd.;od vrste uzorka, tekućina za ispiranje alveole (najizvrsnija)>ispljuvak dubokog kašlja>bris nazofarinksa>orofaringealni bris>krv.Osim toga, virus se također može otkriti u izmetu.Međutim, s obzirom na praktičnost operacije i prihvaćanje pacijenata, uobičajeni klinički redoslijed uzorkovanja je orofaringealni bris> nazofaringealni bris> bronhijalna lavaža (složena operacija) i duboki sputum (obično suhi kašalj, teško ga je dobiti).

Stoga je količina virusa u stanicama orofarinksa ili nazofarinksa kod nekih pacijenata mala ili izrazito niska.Ako se za testiranje uzmu samo uzorci orofarinksa ili nazofarinksa, virusna nukleinska kiselina neće biti detektirana.

(2) Tijekom prikupljanja uzorka nisu prikupljene stanice koje sadrže virus ili virusna nukleinska kiselina nije učinkovito sačuvana.

[① Neprikladno mjesto uzimanja, na primjer, prilikom uzimanja briseva orofaringeusa, dubina uzimanja nije dovoljna, prikupljeni brisevi nazofarinksa ne prikupljaju se duboko u nosnoj šupljini, itd. Većina prikupljenih stanica mogu biti stanice bez virusa;

②Brisevi za uzorkovanje nisu ispravno korišteni.Na primjer, sintetička vlakna kao što su PE vlakna, poliesterska vlakna i polipropilenska vlakna preporučuju se za materijal glave štapića.Prirodna vlakna kao što je pamuk koriste se u stvarnom radu (jaka adsorpcija proteina i nije ih lako isprati) i najlonska vlakna (slabo upijanje vode, što dovodi do nedovoljnog volumena uzorka);

③Nepravilna uporaba epruveta za pohranu virusa, kao što je zlouporaba polipropilena ili polietilenskih plastičnih epruveta za pohranu koje se lako apsorbiraju nukleinske kiseline (DNA/RNA), što dovodi do smanjenja koncentracije nukleinske kiseline u otopini za pohranu.U praksi se preporučuje korištenje polietilen-propilen polimerne plastike i nekih posebno obrađenih polipropilenskih plastičnih spremnika za pohranjivanje virusnih nukleinskih kiselina.]

[① Neprikladno mjesto uzimanja, na primjer, prilikom uzimanja briseva orofaringeusa, dubina uzimanja nije dovoljna, prikupljeni brisevi nazofarinksa ne prikupljaju se duboko u nosnoj šupljini, itd. Većina prikupljenih stanica mogu biti stanice bez virusa;

②Brisevi za uzorkovanje nisu ispravno korišteni.Na primjer, sintetička vlakna kao što su PE vlakna, poliesterska vlakna i polipropilenska vlakna preporučuju se za materijal glave štapića.Prirodna vlakna kao što je pamuk koriste se u stvarnom radu (jaka adsorpcija proteina i nije ih lako isprati) i najlonska vlakna (slabo upijanje vode, što dovodi do nedovoljnog volumena uzorka);

③Nepravilna uporaba epruveta za pohranu virusa, kao što je zlouporaba polipropilena ili polietilenskih plastičnih epruveta za pohranu koje se lako apsorbiraju nukleinske kiseline (DNA/RNA), što dovodi do smanjenja koncentracije nukleinske kiseline u otopini za pohranu.U praksi se preporučuje korištenje polietilen-propilen polimerne plastike i nekih posebno obrađenih polipropilenskih plastičnih spremnika za pohranjivanje virusnih nukleinskih kiselina.]

(4) Rad kliničkog laboratorija nije standardiziran.Uvjeti transporta i skladištenja uzoraka, standardizirani rad kliničkih laboratorija, tumačenje rezultata i kontrola kvalitete ključni su čimbenici koji osiguravaju točnost i pouzdanost rezultata ispitivanja.Prema rezultatima vanjske procjene kvalitete koju je proveo Klinički laboratorijski centar NZK-a od 16. do 24. ožujka 2020., od 844 laboratorija koji su dobili valjane rezultate, 701 (83,1%) bio je kvalificiran, a 143 (16,9%) nisu.Kvalificirani, sveukupni uvjeti laboratorijskog testiranja su dobri, ali različiti laboratoriji još uvijek imaju razlike u sposobnosti rada osoblja, sposobnosti tumačenja pozitivnog uzorka s jednom metom i kontroli kvalitete.

Kako smanjiti lažno negativan rezultat detekcije nukleinske kiseline SARS-CoV-2?

Smanjenje lažno negativnih rezultata u detekciji nukleinske kiseline treba optimizirati iz četiri aspekta stvaranja lažno negativnih rezultata.

(1) Postoji određena količina virusa u stanicama zaražene osobe.Koncentracija virusa u različitim dijelovima tijela osoba za koje se sumnja da su zaražene bit će različita u različitim vremenima.Ako nema ždrijela, može biti u tekućini za ispiranje bronha ili izmetu.Ako se više vrsta uzoraka može prikupiti u isto vrijeme ili u različitim fazama progresije bolesti za testiranje, pomoći će u izbjegavanju lažno negativnih rezultata.

(2) Stanice koje sadrže virus treba prikupiti tijekom prikupljanja uzorka.Ovaj problem može se u velikoj mjeri riješiti jačanjem obuke sakupljača uzoraka.

(3) Pouzdani IVD reagensi.Provođenjem istraživanja o procjeni učinkovitosti detekcije reagensa na nacionalnoj razini i raspravom o postojećim problemima, učinkovitost detekcije reagensa može se dodatno poboljšati i osjetljivost analize.

(4) Standardizirani rad kliničkih laboratorija.Jačanjem obuke laboratorijskog osoblja, stalnim poboljšanjem sustava upravljanja kvalitetom laboratorija, osiguravanjem razumnih podjela i poboljšanjem sposobnosti osoblja za detekciju, moguće je smanjiti lažno negativne rezultate zbog nepravilnog rada laboratorija.

Razlozi ponovnog pozitivnog rezultata testa nukleinske kiseline SARS-CoV-2 kod oporavljenih i otpuštenih pacijenata

“COVID-19 Plan dijagnostike i liječenja (probno sedmo izdanje)” jasno propisuje da je jedan od kriterija za izlječenje i otpuštanje pacijenata s COVID-19 da dva uzastopna uzorka dišnog trakta imaju negativan test nukleinske kiseline (u razmaku od najmanje 24 sata), ali vrlo je malo testova na nukleinsku kiselinu SARS-CoV-2 ponovno bio pozitivan kod otpuštenih pacijenata iz raznih razloga.

(1) SARS-CoV-2 je novi virus.Potrebno je dalje razumjeti njegov patogeni mehanizam, potpunu sliku uzrokovane bolesti i karakteristike tijeka bolesti.Stoga je, s jedne strane, potrebno pojačati zbrinjavanje otpuštenih pacijenata i provoditi 14-dnevno medicinsko promatranje.Provoditi praćenje, zdravstveno praćenje i zdravstveno usmjeravanje kako bi se produbilo razumijevanje cjelokupnog procesa nastanka, razvoja i ishoda bolesti.

(2) Pacijent se može ponovno zaraziti virusom.Akademik Zhong Nanshan rekao je: Budući da izliječeni pacijenti imaju antitijela, SARS-CoV-2 mogu eliminirati antitijela kada ponovno napadnu.Mnogo je razloga, koji mogu biti uzrok oporavka pacijenta, ili mogu biti povezani s mutacijom virusa, ili čak uzrokom laboratorijskih pretraga.Ako se radi o samom virusu, mutacija SARS-CoV-2 može uzrokovati neučinkovitost antitijela koje proizvodi oporavljeni pacijent protiv mutiranog virusa.Ako se pacijent ponovno zarazi mutiranim virusom, test nukleinske kiseline može ponovno biti pozitivan.

(3) Što se tiče laboratorijskih metoda ispitivanja, svaka metoda ispitivanja ima svoja ograničenja.Do otkrivanja nukleinske kiseline SARS-CoV-2 dolazi zbog odabira sekvence gena, sastava reagensa, osjetljivosti metode i drugih razloga koji dovode do toga da postojeći setovi imaju vlastite donje granice detekcije.Nakon što se pacijent liječi, virus u tijelu se smanjuje.Kada je virusno opterećenje u uzorku koji se testira ispod donje granice detekcije, pojavit će se "negativan" rezultat.Međutim, ovaj rezultat ne znači da je virus u tijelu potpuno nestao.Virus može biti nakon prestanka liječenja.Resurgence”, nastavite kopirati.Stoga se preporučuje pregled jednom tjedno unutar 2 do 4 tjedna nakon otpusta.

(4) Nukleinska kiselina je genetski materijal virusa.Virus se ubija nakon što je pacijent podvrgnut antivirusnom liječenju, ali preostali fragmenti virusne RNK još uvijek se zadržavaju u ljudskom tijelu i nisu potpuno izbačeni iz tijela.Ponekad, pod određenim okolnostima, može se više zadržati.Dugo vremena, au ovom trenutku test nukleinske kiseline bit će "prolazno" pozitivan.S produljenjem vremena oporavka pacijenta, nakon što se zaostali fragmenti RNA u tijelu postupno iscrpe, rezultat testa nukleinske kiseline može postati negativan.

(5) Rezultat testa nukleinske kiseline SARS-CoV-2 samo dokazuje prisutnost ili odsutnost virusne RNK, a ne može dokazati aktivnost virusa i je li virus prenosiv.Potrebno je dokazati hoće li pacijent koji ponovno ima pozitivan nalaz nukleinske kiseline ponovno postati izvor infekcije.Potrebno je napraviti kulturu virusa na kliničkim uzorcima i kultivirati “živi” virus kako bi se dokazala njegova zaraznost.

Sažetak

Ukratko, lažno negativni rezultati testa SARS-CoV-2 nukleinske kiseline, pozitivni rezultati ponovnog testa i druga stanja koja nisu u skladu s kliničkim manifestacijama ne mogu se u potpunosti izbjeći.U stvarnom probiru i testiranju preporučuje se kombinirati kliničke simptome, slikovne preglede (CT) i pokuse Laboratorijski test (test nukleinske kiseline + test antitijela specifična za virus) za sveobuhvatnu dijagnozu kako bi se spriječila propuštena dijagnoza i pogrešna dijagnoza.Ako se utvrdi da rezultati testa očito nisu u skladu s kliničkim manifestacijama, preporuča se provesti sveobuhvatnu analizu cijele veze testa (veze prikupljanja uzorka, cirkulacije i obrade) kako bi se isključila rana infekcija virusom SARS-CoV-2, rekurentna infekcija ili kombinacija s drugim respiratornim virusnim infekcijama itd. moguće.Ako uvjeti dopuštaju, preporuča se uzeti osjetljivije uzorke kao što su ispljuvak ili tekućina za ispiranje alveola za ponovno ispitivanje.

Povezani proizvodi:

Komplet za otkrivanje nukleinske kiseline SARS-CoV-2 (metoda multipleksne PCR fluorescentne sonde)


Vrijeme objave: 3. rujna 2021